溶酶体膜蛋白Sidt2对胰岛素颗粒分泌的影响及机制

The secretory abnormalities of islet beta cell is the main pathophysiologic changes in earliest stage of type 2 diabetes. However，the role of lysosomal membrane protein in insulin secretion remains unclear. We found that Sidt2 was a novel lysosomal membrane protein. The preliminary study demonstrated that Sidt2-/- mice showed impaired insulin secretion. On this basis, this project intends to investigate the subcellular distribution of Sidt2 in islet beta cells, and to determin its secretory vesicle membrane location, by using different techniques such as co-immunostaining, laser confocal microscopy and immune electron microscopy. Using the Sidt2-/- beta cell model, we will discover the Sidt2 deficiency influence on the process of insulin granules secretion (in the process such as transfer,priming,docking,fusion and releasing). Using small interfering RNA targeting Sidt2, we will generate Sidt2 deficiency model in MIN6 cells and to verificate the insulin secretion dysfunction in vitro. From the model, we will investigate the Sidt2 defecient effects on the insulin granule secretion pathway by analyzing the expression changes of the second messengers involved in the secretory regulation, and the vesicle secretion-related SNARE proteins. On the base of these analyzing, we will explore the function mechanism of Sidt2 in the insulin secretion, and to reveal the role of the lysosomal membrane protein in the insulin secretion process. Thus, the results will added new contents for the pathogenesis of diabetes and lysosomal membrane proteins function, even in the earliest molecular target for diabetes treatment.

胰岛β细胞分泌异常是2型糖尿病早期的主要病理生理基础，溶酶体膜蛋白在胰岛素分泌中的作用及机制尚不清楚。Sidt2为我们新发现的溶酶体膜蛋白，前期研究发现Sidt2-/-小鼠表现出胰岛β细胞分泌受损。本项目在此基础上，拟利用免疫共染色及激光共聚焦显微镜，免疫电镜观察Sidt2在β细胞内的亚细胞学分布，其是否分布于分泌小泡膜；以Sidt2-/-β细胞为模型，观察Sidt2缺失对胰岛素颗粒分泌的影响环节（转运/动员/融合/释放）；并利用siRNA技术在MIN6细胞复制Sidt2缺失后胰岛素分泌障碍模型，以胞浆内参与分泌颗粒调节的第二信使及小泡分泌相关的SNARE蛋白等变化为主要指标观察Sidt2对胰岛素颗粒分泌/调控途径的影响，探求Sidt2参与/影响胰岛素颗粒分泌的机制，以揭示溶酶体膜蛋白在胰岛素分泌中的角色，为糖尿病发病机制、溶酶体膜蛋白功能研究注入新内容，可提供糖尿病早期生物干预靶点。

胰岛β细胞分泌异常是2型糖尿病早期的主要病理生理基础，溶酶体膜蛋白在胰岛素分泌中的作用及机制尚不清楚。Sidt2为新发现的溶酶体膜蛋白。项目以此为基础，利用免疫双标记及电镜观察Sidt2在β细胞的亚细胞分布。以Sidt2-/-β细胞为模型，观察Sidt2缺失对胰岛素颗粒分泌的影响。利用基因干扰在INS-1细胞复制离体Sidt2缺失模型，以小泡分泌相关的SNARE蛋白为主要指标观察Sidt2对胰岛素颗粒分泌/调控途径的影响，探求Sidt2参与/影响胰岛素颗粒分泌的机制，揭示溶酶体膜蛋白在胰岛素分泌中的角色。经过近3年的实验，已基本完成计划任务书中所列的主要指标，具体包括：1） 明确了Sidt2在胰岛β细胞定位。利用免疫双标，发现部分内源性Sidt2蛋白与胰岛素分泌小泡蛋白VAMP2，insulin有明显的共定位。利用pEX-3(pGCMV/MCS/Neo)质粒成功构建外源性Sidt2表达载体。与insulin共标记发现外源Sidt2与insulin有部分共定位。这表明溶酶体膜蛋白Sidt2分布于胰岛素分泌颗粒膜上。2）寻找到了Sidt2缺失后胰岛素囊泡与胞膜融合障碍的证据。电镜检测发现Sidt2-/-胰岛β细胞小泡分泌异常，表现为融合或动员的小泡明显减少。Sidt2-/-小鼠表现为明显升高的空腹血糖及严重糖耐量减退。GSIS表明Sidt2-/-小鼠有明显的胰岛素分泌缺陷。western分析表明剔除小鼠分泌小泡相关膜融合SNARE蛋白的表达改变。3）明确了Sidt2对胰岛素颗粒分泌/调控途径影响，包括：（1）利用shRNA技术成功在体外成功建立了Sidt2表达下调INS-1细胞模型，并GSIS检测了Sidt2(-/-)细胞的胰岛素分泌能力，Sidt2-shRNA处理的INS-1细胞，胰岛素分泌能力明显下降。（2）在Sidt2-shRNA处理的INS-1细胞，SNARE蛋白表达明显受到影响（4）我们发现外源性Sidt2的过表达能部分纠正Sidt2剔除小鼠胰岛的分泌缺陷。综上，Sidt2作为溶酶体膜蛋白在胰岛β细胞参与了胰岛素分泌颗粒膜的组成，也是胰岛素分泌颗粒膜蛋白，其通过对SNAREs蛋白的调节而影响胰岛素分泌小泡与靶膜的融合，最终影响胰岛素分泌，参与糖尿病的发病。项目的完成深化了我们对溶酶体膜蛋白的功能及糖尿病发病机制的认识，为糖尿病的发病干预找到了新的作用靶点。

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