南药道地高良姜内生菌的种群分布及对高良姜的诱导效应

高良姜（Alpinia officinarum Hance）是一种热带多年生的山姜属食药兼用的植物。是世界著名汉药二天油、驱风油、清凉油、万金油最主要原料来源。其主要药效成分高良姜素和按油精还具有多种药理作用。但该植物生长周期长，且不同产地有效成分含量及药效存在极大差异。研究证实，植物内生菌在促进药用植物生长及活性成分合成和积累中具有重要的作用。本项目开展重要南药道地高良姜内生菌种群结构及对高良姜的诱导效应研究，旨在为了解道地高良姜形成的内在因素、进而进一步提高高良姜的品质和药效成分含量、建立更高效的生产栽培方式、为利用细胞培养方法生产高良姜素和桉油精提供参考和技术支撑。有学者认为植物内生菌可能是影响药材道地性的直接因素。但该领域相关研究还非常之少。本项目同时开展不同产地、不同品质高良姜内生菌与道地高良姜内生菌差异研究，可为从内生菌着手阐释道地药材形成机理新思路的可行性提供直接数据和参考。

采用传统的分离培养方法，从道地产地（广东省徐闻县龙塘镇）高良姜根茎、茎、叶和根4个不同组织共计分离细菌176株，真菌95株；可培养内生细菌主要组成芽孢杆菌、考克氏菌、类芽孢杆菌、短芽孢杆菌、根瘤菌、甲基杆菌、伯霍尔德菌、泛菌、及鞘氨醇单胞菌等不同类群，以芽孢杆菌、甲基杆菌为其最大、次优势类群；可培养内生真菌主要组成刺盘孢霉、青霉、小丛壳菌、喙状明脐菌、拟孢多毛菌、镰刀菌、支孢霉、梨孢霉等不同类群，以刺盘孢霉为其优势类群。道地高良姜可培养内生细菌、内生真菌其种群组成、优势种群均随该植物组织及生长年份而显著不同，一些种群具有一定的组织喜好性。.采用T-RFLP 免培养方法，从道地高良姜4个组织16s rDNA PCR产物中检测到36个HhaI 单酶消化的末端限制性酶切片段(T-RFs)。种群对应分析显示其免培养内生细菌群体主要由芽孢杆菌、甲基杆菌、海洋螺菌、红杆菌、交替假单胞菌、热带根瘤菌及沼泽考克氏菌等组成；构建高良姜免培养内生真菌群体rDNA ITS克隆文库，序列系统进化分析显示其免培养真菌群体组成糙孢孔菌、小皮伞菌、蜡壳耳菌、拟盘多毛孢霉、刺盘孢霉、青霉、镰刀菌等12个不同种群，以拟盘多毛孢菌作为其优势种群。 .采用T-RFLP免培养方法分析了高良姜不同组织、不同生长年份、及不同产地共计15个不同高良姜样品内生细菌、真菌群体；测定了所有样品中高良姜素、挥发油及1,8-桉油精含量。对内生真菌群体聚类、NMDS分析显示高良姜内生真菌群体在其主要活性成分含量基础上分组；高良姜素及挥发油与其内生真菌群体Shannon 多样性指数及其相应的均匀度呈极显著的负相关（Pearson相关系数≦-0.962）；与325bp（对应于拟盘多毛孢菌）的优势T-RF呈极显著的正相关（相关系数≥0.975）；所测活性成分与其免培养内生细菌群体没有明显的相关性。.对所有分离的内生菌进行体外合成挥发油、桉油精和高良姜素筛选，4个菌株显示高良姜素产生潜力；1个菌株显示挥发油合成能力；研究了部分菌株对其宿主高良姜离体培养及插扦生长中活性物质合成及生长的影响，及对非宿主水稻抗逆促生作用，结果显示所检测的菌株对高良姜素及按油精积累影响不明显，但多个菌株能显著提高其宿主及非宿主冷胁迫、及多种重金属胁迫抗性。

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