里氏木霉sorbicillinoid类次级代谢产物生物合成机制的研究

Sorbicillinoids are typical polyketide secondary metabolites produced by filamentous fungi such as Penicillium and Trichoderma spp. Due to the unique structures and diverse bioactivities, their biosynthetic mechanisms have attracted extensive attentions. However, the biosynthetic gene cluster and pathway of sorbicillinoids remain unclear so far. For the first time, our preliminary studies demonstrated that the important industrial producer of cellulases - Trichoderma reesei is capable of synthesizing sorbicillinoid compounds. We have located the candidate gene cluster likely responsible for sorbicillinoid biosynthesis through mining the genome of T. reesei QM6a strain. In order to understand the unique mechanisms for sorbicillinol assembly and monomer oligomerization, in this project, we propose to determine the boundaries of this gene cluster and the function of each biosynthetic gene by in-frame gene deletion. In the meantime, the research team is aimed to identify the key enzyme(s) involved in the transformation from monomer compounds to complex sorbicillinoid oligomers through heterologous protein expression and in vitro activity reconstitution. This study will provide theoretical and experimental basis for the design and development of new sorbicillinoid derivatives with improved bioactivities.

Sorbicillinoids是木霉、青霉等高等丝状真菌产生的特征性聚酮类次级代谢产物。由于化学结构独特、生物活性多样，其生物合成机制广受关注，但直至目前仍未阐明。我们的前期工作首次发现工业纤维素酶生产菌里氏木霉也具有合成sorbicillinoid类化合物的能力，通过深入的基因组序列分析，成功锁定其生物合成基因簇。为了阐明sorbicillinoids聚酮单体的合成途径及其独特的单体聚合机制，本项目拟通过定点基因敲除技术对其关键基因进行逐一敲除，确定该类化合物生物合成基因簇的边界和每个基因的生物学功能；同时采用蛋白异源表达和体外酶反应重建的方式寻找催化单体化合物sorbicillinol聚合形成复杂sorbicillinoid类化合物的关键酶，深入理解该家族化合物的生物合成机制，为未来设计和创造新的sorbicillinoid类活性产物提供理论和实验基础。

Sorbicillinoids是一类由真菌产生的己烯酮结构骨架的聚酮类化合物，其复杂的化学结构和多样化的生物学活性激发了科学家们的研究兴趣。尽管有研究者利用体外实验确定了产黄青霉黄素单加氧酶SorbC的功能，但对该菌株进行的所有基因敲除尝试均以失败告终。因而截至基金申报时，有关该类化合物生物合成途径假说的提出很大程度上仍然基于间接证据，而具体负责催化合成该类化合物的生物合成酶大多未获得鉴定。因此，本项目以里氏木霉QM6a为研究对象，利用化合物分离鉴定、生物合成基因簇锁定、关键基因的敲除及敲除菌株发酵鉴定等手段，对里氏木霉产生的sorbicillinoids化合物进行了分离鉴定并基本阐明了其生物合成机制。首先，本研究在QM6a的发酵产物中分离获得了六种sorbicillinoids化合物，并通过外源添加SAHA培养的方式，获得了4种甾醇类化合物。接下来，通过基因组扫描分析锁定了里氏木霉sorbicillinoids生物合成基因簇及其关键合成基因，并通过关键基因敲除后发酵分析阐明了这些基因的功能及sorbicillinoids生物合成途径。其中聚酮合酶TrsorA负责己二烯酰侧链的合成；而聚酮合酶TrsorB负责将TrsorA产物继续延伸并释放环化，生成sorbicillin（2’-3’Dihydrosorbicillin）；黄素单加氧酶TrsorC氧化sorbicillin（2’-3’ Dihydrosorbicillin）生成sorbicillinol（2’-3’ Dihydrosorbicillinol）；最后TrsorF催化单体sorbicillinoids聚合形成各种复杂的sorbicillinoids化合物。通过本项研究的开展，基本阐明了sorbicillinoids化合物生物合成机制，为未来设计和创造新的sorbicillinoids活性产物提供理论和实验基础。

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