Mechanistic insights into multifaceted roles of coronavirus exoribonuclease complex

冠状病毒外核糖核酸酶复合物多方面作用的机制见解

基本信息

  • 批准号:
    10713523
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 38.25万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2023
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2023-08-01 至 2028-05-31
  • 项目状态:
    未结题

项目摘要

As SARS-CoV-2 continues to wreak havoc across the globe, it is imperative to understand the mechanism and regulation of the viral genome replication and transcription, which are essential processes in coronavirus life cycle and represent important targets for therapeutic interventions. Coronavirus genome replication and transcription are carried out by a dynamic replication-transcription complex (RTC), assembled from an array of viral non-structural proteins (nsps). Within the RTC, a unique proofreading exoribonuclease (ExoN) complex, nsp14-nsp10, boosts replication fidelity by excising mis-incorporated nucleotides and many antiviral nucleotide analogs. In addition to its role in proofreading viral RNA synthesis, the ExoN complex is also involved in viral RNA 5′ capping, which is critical for immune evasion by coronaviruses. Despite extraordinary efforts in studying coronavirus biology and replication, major gaps remain in our understanding of the key roles ExoN complex plays in various fundamental aspects of coronavirus life cycle. First, it is unclear how ExoN complex coordinates with the low-fidelity viral polymerase to proofread RNA synthesis. Second, it is poorly understood how ExoN complex is modulated by viral cofactors. Third, it is unknown how the two different enzymatic functions, RNA cleavage and capping activities, of ExoN complex are coupled in the virus life cycle. The central objective of our proposed experiments is to fill these gaps in understanding through a systematic dissection of the structural basis and functional roles of ExoN complex and its dynamic interlay with viral cofactors in viral RNA synthesis and processing. We will use SARS-CoV-2 as a model system and employ a combination of cryo-electron microscopy, single-molecule biophysics, protein-RNA biochemistry, and cell virology to achieve this central goal through the following aspects: Project 1, coordination of polymerase and exoribonuclease during mismatch correction. We will define the mechanism by which RNA mismatches are transferred from polymerase to ExoN and identify the molecular determinants for their functional interplay. Project 2, modulation of ExoN complex by viral cofactors. We will elucidate the molecular details of the interaction between ExoN complex and a key RTC subunit, nsp8, and determine how this interaction modulates the proofreading activity of ExoN complex during mismatch correction. Project 3, coupling of RNA exonucleolytic digestion and 5′ capping activities of ExoN complex. Building on our newfound cryo-EM structure of a dimeric form of the ExoN complex in which its RNA digestion and capping activities are coupled, we will determine the molecular and biochemical underpinnings and establish the physiological significance of the functional link between the two enzymatic activities of ExoN complex. Through this research program, we will reveal the principles and molecular details governing the multifaceted roles of this unique viral RNA proofreader and provide new insights into the mechanisms and regulation of coronavirus genome replication and transcription. More broadly, the established tools and experimental platforms are readily applicable to studying other RNA viruses.
随着 SARS-CoV-2 继续在全球范围内造成严重破坏,了解其机制和预防疾病势在必行。 病毒基因组复制和转录的调节,这是冠状病毒生命中的重要过程 循环并代表了冠状病毒基因组复制和治疗的重要目标。 转录是由动态复制转录复合体(RTC)进行的,该复合体由一系列 RTC 内的病毒非结构蛋白 (nsps),是一种独特的核糖核酸外切酶 (ExoN) 复合物, nsp14-nsp10,通过切除错误掺入的核苷酸和许多抗病毒核苷酸来提高复制保真度 ExoN 复合物除了在校对病毒 RNA 合成中发挥作用外,还参与病毒的合成。 尽管研究工作付出了巨大努力,但 RNA 5' 加帽对于冠状病毒的免疫逃避至关重要。 冠状病毒生物学和复制,我们对 ExoN 复合物关键作用的理解仍存在重大差距 首先,ExoN 复合物如何协调尚不清楚。 其次,人们对 ExoN 的作用知之甚少。 第三,两种不同的酶(RNA)如何发挥作用尚不清楚。 ExoN 复合物的切割和加帽活性在病毒生命周期中是耦合的。 我们提出的实验是通过对结构的系统剖析来填补这些理解上的空白 ExoN复合物的基础和功能作用及其与病毒辅因子在病毒RNA合成中的动态相互作用 我们将使用 SARS-CoV-2 作为模型系统,并采用冷冻电子的组合。 显微镜、单分子生物物理学、蛋白质-RNA生物化学和细胞病毒学来实现这一中心目标 通过以下几个方面: 项目一、错配过程中聚合酶和核糖核酸外切酶的协调 我们将定义 RNA 错配从聚合酶转移到 ExoN 的机制。 并确定其功能相互作用的分子决定因素 项目 2,通过调节 ExoN 复合物。 我们将阐明 ExoN 复合物与关键 RTC 之间相互作用的分子细节。 亚基、nsp8,并确定这种相互作用如何在过程中调节 ExoN 复合物的校对活性 错配校正项目 3,RNA 核酸外切消化和 ExoN 5' 加帽活性的耦合 以我们新发现的 ExoN 复合物二聚体形式的冷冻电镜结构为基础,其中含有 RNA。 消化和加帽活动是耦合的,我们将确定分子和生化基础 并建立 ExoN 两种酶活性之间功能联系的生理意义 通过这个研究项目,我们将揭示控制这一复杂现象的原理和分子细节。 这种独特的病毒 RNA 校对器具有多方面的作用,并为机制和提供了新的见解。 更广泛地说,是对冠状病毒基因组复制和转录的调控。 实验平台很容易适用于研究其他RNA病毒。

项目成果

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知道了