Recombinant DNA technologies for multiplex genetic assays in human cells

用于人体细胞多重基因检测的重组 DNA 技术

基本信息

  • 批准号:
    10622541
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 40.25万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2021
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2021-08-01 至 2026-05-31
  • 项目状态:
    未结题

项目摘要

PROJECT SUMMARY Advances in high throughput sequencing have already revealed millions of protein coding variants within human exomes, and there are many millions of additional differences that likely exist but have not yet been observed. Many of these variants likely play important roles influencing human health, but we lack the clinical data required to associate each variant genotype with their corresponding phenotypes. This disconnect is oftentimes referred to as the variant interpretation problem. Genetic experiments in model systems play a critical role in uncovering the effects of protein coding variants, but traditional approaches typically test variants one-by-one and will never address this glut of uncharacterized variants. Multiplex genetic assays capable of simultaneously testing complex variant libraries have the required throughput, but these approaches are still in their developmental infancy, and improvements are needed to increase the capabilities, costs, efficiency, and usability of these techniques to successfully address this problem. Harnessing a palette of synthetic biology tools centered around the highly efficient Bxb1 bacteriophage DNA recombinase, I developed a user-friendly, highly customizable platform for expression of complex variant libraries within individual cultured human cells. I previously paired this expression system with a highly generalizable assay that identifies variants that are loss-of-function due to an reduced intracellular steady-state abundance. I applied this assay to comprehensively study variants in four disease- related proteins, and more collaborative projects are still in progress. Unfortunately, these methods alone will not address the problem, and more orthogonal approaches are needed to tackle the millions of uncharacterized disease-relevant variants that exist within people. The goal of this proposal is to build the next set of fundamental biotechnologies needed to enable more high-throughput characterizations of protein variants. The individual directions described are each highly generalizable and can be reapplied to study large swaths of the proteome with only slight modification. Immediate directions include a functional complementation system to study essential genes, a fluorescent transcriptional reporter system to study perturbations to intracellular signaling pathways, and a barcoded ORFeome collection to identify genes that modulate phenotypes of interest when they are overexpressed. A major purpose of these technologies is to facilitate adoption by other research groups, especially those that are experts in other biological fields. These developments, along with the data we generate in the process of demonstrating their utility, will directly address the variant interpretation problem while also uncovering previously hidden biology underlying cancer-related molecular mechanisms critical to cell function.
项目摘要 高吞吐量测序的进步已经显示出数百万蛋白质编码变体 在人类外体内,还有许多其他可能存在但尚未存在的差异 被观察到。这些变体中的许多可能都扮演着影响人类健康的重要角色,但我们缺乏 将每个变体基因型与相应的表型相关联所需的临床数据。这 断开通常被称为变体解释问题。模型中的基因实验 系统在发现蛋白质编码变体的影响方面起着关键作用,但是传统方法 通常,测试变体一对一,永远不会解决这种不明显的变体。多路复用 能够同时测试复杂变体库的遗传测定具有所需的吞吐量,但 这些方法仍处于其发展期,需要改进以增加 这些技术成功解决此问题的能力,成本,效率和可用性。 利用围绕高效BXB1的合成生物学工具的调色板 噬菌体DNA重组酶,我开发了一个用户友好,高度可定制的平台,以表达 单个培养的人类细胞中的复杂变体文库。我以前配对了这个表达系统 具有高度概括的测定法,该测定标识了由于降低而导致功能丧失的变体 细胞内稳态丰度。我将此测定应用于四种疾病的全面研究变体 相关蛋白质和更多协作项目仍在进行中。不幸的是,仅这些方法将 无法解决问题,需要更多的正交方法来解决数百万 人体内部存在的与疾病相关的变体。 该提案的目的是建立下一套启用所需的基本生物技术 蛋白质变体的更多高通量表征。所描述的各个方向是每个方向 高度可概括,可以重新使用以研究大量蛋白质组,只有轻微 修改。直接的方向包括一个功能补充系统,用于研究基本基因 荧光转录记者系统研究对细胞内信号通路的扰动,A 条形码的Orfeome收集以识别调节感兴趣表型时的基因 过表达。这些技术的主要目的是促进其他研究小组的采用, 特别是那些在其他生物领域的专家。这些发展,以及我们的数据 在演示其实用程序的过程中生成,将直接解决变体解释问题 同时还发现了以前隐藏的生物学与癌症相关的分子机制至关重要 细胞功能。

项目成果

期刊论文数量(1)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Multiplex Functional Characterization of Protein Variant Libraries in Mammalian Cells with Single-Copy Genomic Integration and High-Throughput DNA Sequencing.
通过单拷贝基因组整合和高通量 DNA 测序对哺乳动物细胞中蛋白质变体文库进行多重功能表征。
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