Split-GFP tagging and live imaging of hair cell proteins

毛细胞蛋白的 Split-GFP 标记和实时成像

基本信息

  • 批准号:
    10623203
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 20.19万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2022
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2022-06-01 至 2024-05-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Over the past few decades, the hair cell field has gained great insight into the inner workings of hair cells, the sensory receptors that mediate our sense of hearing and balance. The molecular identity of many factors important for hair cell development and function, and their significance for hearing loss, have been elucidated. Despite this progress, the study of hair cells presents many challenges. In particular live-cell imaging and tracking of proteins, important pillars of cell biology studies, have been especially difficult, mainly due to limited means to transfect and culture hair cells. Considering that the essence of hair cell function is micro- and nanoscale movement, investigations of the dynamic properties of proteins is crucial for a complete understanding of hair cell function. The goal of this proposal therefore is to develop a tool that makes imaging of protein movements in living hair cells more accessible. The gold standard technique for tracking protein movement is live-cell imaging of tagged proteins. Traditionally, this is achieved by expression of exogenous DNA constructs fused to fluorescent proteins, delivered to cells by gene gun, electroporation or viruses. Transgenic mice also have been employed. These approaches, however, are potentially confounded by overexpression artifacts and low transduction/transfection efficiency. Knock-in (KI) of genetically-encoded fluorescent tags into the endogenous gene loci has become more tractable through modern genome editing methods, but KI of large DNA segments, such as the full-length GFP coding sequence, remains difficult and has the potential to affect gene expression. To address these challenges, we plan to develop a mouse tool kit that streamlines fluorescent tagging of proteins for localization and live cell imaging. To this end, we adopted the Split-GFP strategy. In this two- component system, the endogenous gene of interest is genetically tagged with a small part of GFP (“GFP11”). Co-expressing the remaining (non-fluorescent) portion of GFP (“GFP1-10”) reconstitutes GFP fluorescence, allowing imaging by fluorescence microscopy. Due to the small size of the GFP11 fragment (48 bps), CRISPR- mediated KI into the endogenous loci is highly efficient. In preliminary studies, we confirmed that the Split-GFP approach faithfully recapitulates the endogenous localization of the cuticular plate protein LMO7, by delivering AAV-packaged GFP1-10 into the hair cells of Lmo7-GFP11 KI mice. To circumvent AAV-mediated delivery, we propose to generate a transgenic mouse line that expresses the GFP1-10 fragment. Founders have already been obtained and germline transmission was confirmed (SA1). This system will be tested on live-imaging tasks of increasing difficulty: In SA2, we will study the diffusion kinetics and movement of LMO7 in the hair cell. In SA3, challenging the sensitivity limits of this system, we will investigate the dynamics of the tip link motor complex component USH1C in the hair bundle.
在过去的几十年中,毛细胞场在毛细胞的内部运作中获得了很大的成就, 介导听力和平衡的感觉受体。 对于毛发细胞的发育和功能及其对听力损失的重要性很重要。 尽管取得了这种进步,但对毛细胞的研究仍带来了许多挑战。 追踪蛋白质,细胞生物学研究的重要支柱,特别是由于有限的 考虑毛细胞功能的本质是微细胞的转染和培养毛细胞 纳米级运动,研究至关重要的蛋白质的动态特性至关重要 理解毛细胞功能。 活毛细胞中的蛋白质运动更容易获得。 跟踪蛋白质运动的黄金标准技术,传统上是标记蛋白的活细胞成像。 这是通过表达与荧光蛋白融合的外源DNA构建体的表达来实现的,该构建体通过 基因枪,电穿孔或转基因小鼠。 有可能被过表达的伪像和较低的转化/变换效率混淆 (ki)遗传编码的荧光标签进入内源基因位点已通过 现代基因组编辑方法,但是大型DNA段的Ki,例如全长GFP编码序列, 仍然存在差异,并具有影响基因表达的潜力。 为了应对挑战,我们计划开发一个鼠标工具套件,该工具包将荧光标记 蛋白质用于定位和活细胞成像。 组件系统,感兴趣的内源基因在遗传上用GFP的一小部分(“ GFP11”)标记。 共表达GFP(“ GFP1-10”)的剩余(非荧光)部分。 允许通过荧光显微镜进行成像。 介导的Ki进入内源基因座是高度效率的。 通过交付 AAV包装的GFP1-10进入LMO7-GFP11 ki小鼠的毛细胞。 提议生成表达GFP1-10片段的转基因小鼠系。 已获得并确认生殖线(SA1)。 增加差异的任务:在SA2中,我们将研究毛细胞中LMO7的扩散动力学和运动。 在SA3中,挑战系统的灵敏度限制,我们将调查尖端链路电机 复杂的组件USH1C在头发束中。

项目成果

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