Molecular mechanism of PIN1-mediated regulation of the nuclear receptor PPARy

PIN1介导的核受体PPARγ调节的分子机制

基本信息

项目摘要

Project Summary/Abstract Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) is a ligand sensitive nuclear receptor and master regulator of adipogenesis. There exist FDA approved drugs that bind the ligand binding domain (LBD) of PPARγ to induce a well characterized conformational change, which alters the activity of this transcription factor. However, the functionally critical N-terminal intrinsically disordered AF1 domain remains poorly understood from a structural standpoint due to the limited number of biophysical methods that can provide atomic level detail of binding interactions and AF1 conformational states. Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1 (PIN1) is a known protein binding partner of PPARγ that exerts its catalytic activity specifically at pSer/pThr-Pro motifs, facilitating the cis/trans isomerization of proline bonds along the peptide backbone. Preliminary data from our lab and others suggest PIN1 binds the AF1 region of PPARγ with a much greater affinity than the LBD, an observation which presents the opportunity to better understand the role of AF1 function in PPARγ biology. This binding interaction suggests a cascade of post translational modifications (PTMs), including kinase-mediated phosphorylation and PIN1 enzyme-catalyzed proline cist/trans isomerization of the AF1 region, may be responsible for tuning the transcriptional activity of PPARγ and maintaining activation of adipogenic gene programs. In this project I will use nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to monitor PTM (phosphorylation and isomerization) induced changes in AF1 conformational states and correlate this data with cellular function associated with PPARγ-mediated gene programs that influence adipogenesis and insulin sensitization. Aim 1 of this project outlines the use of NMR methods to monitor and describe the phosphorylation- dependent and isomerization-dependent conformational changes the AF1 domain undergoes. These NMR studies will be complemented by kinetic and structural insight gleaned from biolayer interferometry (BLI) experiments to measure binding affinity of AF1 peptides to PIN1, X-ray crystallography studies of PIN1 in complex with AF1 peptides, and cross-linking mass spectrometry (XL-MS) using full length PPARγ and PIN1 to identify intermolecular protein contacts which may not be exclusive to the AF1 domain. To correlate the structural and molecular mechanisms described by Aim 1 with functional effects observed in cells, Aim 2 of this project uses structure-guided mutagenesis, transcriptional reporter assays, and knockdown experiments in pre- adipocytes to understand the role of PIN1 as a mediator of PPARγ function during adipogenesis. Gene expression analysis and assays that measure cellular endpoints associated with PPARγ function will further assess the roles of these PTMs within the AF1 domain in promoting adipogenic function.
项目摘要/摘要 过氧化物体增生剂激活受体伽马(PPARγ)是配体敏感核受体,并且 脂肪形成的主要调节剂。存在FDA批准的药物,该药物结合了配体结合结构域(LBD) PPARγ引起了良好的会议变化,从而改变了该转录因子的活性。 但是,功能上关键的N端本质上无序的AF1结构域从 由于生物物理方法数量有限,可以提供原子水平的细节,因此 结合相互作用和AF1构象状态。肽基 - 丙酰基/反式异构酶NIMA相互作用1 (PIN1)是PPARγ的已知蛋白质结合伴侣,其在PSER/PTHR-PRO上执行其催化活性 主题,支持沿辣椒主链的脯氨酸键的顺式/反式异构化。初步数据 我们的实验室和其他人认为PIN1与PPARγ的AF1区域结合,其亲和力比LBD更大, 观察结果为更好地了解AF1功能在PPARγ生物学中的作用提供了机会。这 结合相互作用表明一系列级联转化修饰(PTM),包括激酶介导的 AF1区域的磷酸化和PIN1酶催化的脯氨酸CIST/反式异构化可能为 负责调整PPARγ的转录活性并维持成生基因的激活 程序。在这个项目中,我将使用核磁共振(NMR)光谱监测PTM (磷酸化和异构化)诱导AF1构象状态的变化,并将这些数据与 与影响脂肪生成和胰岛素的PPARγ介导的基因程序相关的细胞功能 致敏。该项目的目标1概述了使用NMR方法监测和描述磷酸化的方法 依赖和异构化依赖性咨询改变了AF1域的经历。这些NMR 研究将通过生物层干扰(BLI)的动力学和结构见解完成 测量AF1辣椒与PIN1的结合亲和力的实验,PIN1的X射线晶体学研究 与AF1肽配合物,并使用全长PPARγ和PIN1 TO交联质谱法(XL-MS) 确定可能不是AF1结构域独有的分子间蛋白接触。关联结构 AIM 1描述的分子机制具有在细胞中观察到的功能效应,该项目的AIM 2 使用结构引导的诱变,转录报告基因测定和敲低实验 脂肪细胞理解PIN1作为脂肪生成过程中PPARγ功能的介体的作用。基因 表达分析和测量与PPARγ功能相关的细胞终点的测定将进一步 评估这些PTM在AF1结构域在促进掺杂功能中的作用。

项目成果

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