BYPASS MECHANISMS IN EUKARYOTIC REPLICATION

真核复制中的旁路机制

基本信息

  • 批准号:
    10249266
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 24.9万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2018
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2018-09-01 至 2023-08-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT Chromosomes are copied by a complex holoenzyme called the replisome. Obstacles are routinely negotiated by the replisome with auxiliary mechanisms that ensure genomic integrity, aberrance of which can lead to chromosome instability and a broad range of diseases including cancer. The candidate’s long term goal is to understand the molecular basis for genetic and epigenetic fidelity, with the potential to improve the treatment and/or prevention of disease. In this proposal, the candidate will use a fully functional replisome reconstituted from over 30 pure polypeptides to study how replisomes bypass obstacles that regularly occur in the genome while enforcing genetic and epigenetic integrity across generations. In the first specific aim the candidate’s current work on the molecular mechanisms of lesion bypass by the replisome will be elaborated, with a focus on how checkpoint kinases Mec1 and Rad53 and the Mrc1/Tof1/Csm3 (MTC) complex modify the activity of the replisome while regulating lesion bypass. Interactions between several key replisome components and the MTC complex will be probed by microscale thermophoresis (MST) and cross-linking mass spectrometry (XL- MS). In addition to biochemical experiments, single-molecule approaches will be used to probe the mechanism of replisome regulation by the MTC complex, resolving replisome components with fluorescence during active replication on DNA. Single-molecule FRET experiments will be used in the independent phase to probe how MTC affects the structural dynamics of the replisome. In the second aim, the candidate will investigate nucleosome bypass by the replisome, focusing on the post-replication fate of histones during the mentored phase. Using histones enriched for fluorescence, replication-coupled histone deposition will be tracked by a first-of-its-kind attempt at spatially resolving leading vs. lagging strand products with a combination of optical trapping, fluorescence, and flow. Along with bead-based biochemical experiments, the results will help differentiate between models of epigenetic inheritance. In the independent phase, interactions between the replisome and FACT, a histone chaperone, will be determined with MST and XL-MS. The molecular mechanisms of various chaperones will be probed using single-molecule FRET experiments monitoring the spatiokinetics of chromatin remodeling in real time, also determining the role of histone modifications in remodeling. The mentored phase of the project will be conducted in the laboratories of Dr. Michael O’Donnell (mentor) and Dr. Shixin Liu (co-mentor) at Rockefeller University, a world-class research environment. The success of the candidate’s proposed research depends critically on using advanced integrative single-molecule techniques, as well as XL-MS. Thus, the candidate seeks intensive training with manipulation and detection of individual molecules in the co-mentor’s state-of-the-art facilities, in addition to XL-MS with Drs. Brian Chait and Yi Shi (collaborators). The candidate also has also planned activities to improve mentoring, lab management, scientific communication, and professional skills, enabling a successful transition to an independent career.
项目摘要/摘要 染色体由称为复制体的复杂全酶复制。常规谈判障碍 通过具有确保基因组完整性的辅助机制的复制体,其异常可能导致 Chromesly不稳定和包括癌症在内的广泛疾病。候选人的长期目标是 了解遗传和表观遗传保真度的分子基础,并有可能改善治疗 和/或预防疾病。在此提案中,候选人将使用功能齐全的复制体重构 从30多种纯多肽到研究复制体如何绕过基因组中经常发生的障碍 同时在世代相传的遗传和表观遗传完整性。在第一个特定目标中,候选人的 将详细阐述有关复制体病变旁路分子机制的当前工作,重点是 关于检查点激酶MEC1和RAD53以及MRC1/TOF1/CSM3(MTC)复合物如何修改活性 控制病变旁路时的复制体。几个关键复制体组件与 MTC复合物将通过微观嗜热(MST)和交联的质谱法(XL-- 多发性硬化症)。除了生化实验外,单分子方法还将用于探测机制 通过MTC复合物调节复制体的调节,在活动过程中解决具有荧光的复制组成分 对DNA的复制。单分子FRET实验将在独立阶段使用,以探测如何 MTC影响复制体的结构动力学。在第二个目标中,候选人将调查 复制体的核小体搭桥术,重点介绍了此问题期间组蛋白的复制后命运 阶段。使用富含荧光的组蛋白,复制偶联的组蛋白沉积将通过A跟踪 首先尝试使用光学组合的领先与滞后链产品进行空间解决的尝试 捕获,荧光和流动。除了基于珠子的生化实验外,结果将有助于 区分表观遗传遗传模型。在独立阶段, Replicasome and Fact,Hisstone伴侣,将由MST和XL-MS确定。分子 将使用单分子FRET实验探测各种伴侣的机制 实时染色质重塑的spatiokinetics,还确定组蛋白修饰在 重塑。该项目的修改阶段将在迈克尔·奥多内尔博士的实验室中进行 (导师)和洛克菲勒大学(Rockefeller University)的Shixin Liu博士(世界一流的研究环境)。这 候选人提议的研究的成功取决于使用先进的集成单分子 技术以及XL-MS。这是候选人寻求操纵和检测的深入培训 除XL-MS外,同事的最先进设施中的单个分子。 Brian Chait和 Yi Shi(合作者)。候选人还计划了改善心理,实验室管理的活动, 科学沟通和专业技能,可以成功地过渡到独立职业。

项目成果

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