Arg and cortactin regulation of the Arp2/3 complex and its role in dendritic spine stability

Arp2/3 复合物的 Arg 和 cortactin 调节及其在树突棘稳定性中的作用

• 批准号: 9794652
• 负责人: Juliana Gentile
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: YALE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2018-09-14 至 2020-04-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9794652
• 关键词: Actins; Address; Adolescence; Affect; Affinity; Behavior; Binding; Biochemical; Biological Assay; Chemicals; Color; Complement; Complex; Confocal Microscopy; Cytoskeleton; Data; Dendritic Spines; Disease; EMS1 gene; Economic Burden; F-Actin; Filament; Fluorescence Recovery After Photobleaching; Foundations; Hippocampus (Brain); Learning; Left; Maintenance; Measures; Mediating; Mental disorders; Methods; Microscopy; Modeling; Neurons; Pathology; Photobleaching; Protein Tyrosine Kinase; Proteins; Recovery; Regulation; Research; Role; Structure; Synapses; Testing; Therapeutic Intervention; Time; Total Internal Reflection Fluorescent; Vertebral column; Work; base; cohort; crosslink; experimental study; interdisciplinary approach; knock-down; mutant; nervous system disorder; neuron loss; premature; recruit; single molecule; social

Project Summary   Dendritic spine stability is disrupted in psychiatric and neurological disorders. Dendritic spines are enriched in a  highly branched cytoskeleton, containing stable and dynamic filamentous-­ (F-­) actin pools and monomeric actin.  Loss of the Abl2/Arg non-­receptor tyrosine kinase (Arg) and its interaction partner cortactin from dendritic spines  causes  widespread  spine  loss  in  late  adolescence,  but  the  mechanisms  of  how  these  two  proteins  support  dendritic  spine  stability  remain  elusive.  Our  lab  recently  showed,  using  total  internal  reflection  microscopy  (TIRFM)  single-­filament  based  assays,  that  Arg  and  cortactin  synergize  to  regulate  Arp2/3-­mediated  actin  branching.  Coordinated  regulation  of  the  Arp2/3  complex  via  Arg  and  cortactin  is  a  plausible  mechanism  by  which these proteins support spine stability. In my research plan, I will test the hypothesis that Arg and cortactin  interact  to  confer  dendritic  spine  stability  via  regulation  of  the  Arp2/3  complex  and  maintenance  of  the  spine  stable actin pool.  Aim 1. To determine how Arg interacts with cortactin and the Arp2/3 complex to promote actin branch  nucleation.  It  remains  unresolved  how  Arg  regulates  the  Arp2/3  complex  and  how  cortactin  coordinates  with  Arg  to  enhance  this  effect.  To  address  how  Arg  regulates  the  complex,  I  will  learn  how  to  conduct  functional  TIRFM single-­ filament based assays to define the minimal domain of Arg that is sufficient to activate the Arp2/3  complex. My preliminary data indicate that Arg can directly bind the Arp2/3 complex. I will expand these binding  assays and learn how to conduct chemical crosslinking experiments to determine (1) the minimal Arg fragment  that can make a high affinity interaction with the Arp2/3 complex and (2) the subdomain contacts through which  Arg interacts with the Arp2/3 complex, respectively. Finally, I will develop two methods to determine how cortactin  can  coordinate  with  Arg  to  stimulate  Arp2/3  activation.  Two-­color  single  molecule  TIRF  assays  will  address  if  cortactin  recruits  Arg  to  branch  points  and  competition  binding  assays  will  determine  if  cortactin  functions  (mechanistically) to release Arg from nascent branch points, allowing filament elongation.  Aim  2.  To  determine  the  mechanisms  through  which  Arg  and  cortactin  regulate  spine  stability.  Arg,  cortactin  and  the  Arp2/3  complex  are  concentrated  in  dendritic  spines  and  each  is  required  for  spine  stability,  but how they interact to confer this stability is not understood. Preliminary data collected in the lab suggests that  loss of cortactin initially reduces stable F-­actin prior to dendritic spine destabilization. Using well-­defined Arg or  cortactin mutants, I will perform knockdown/complementation and confocal microscopy in cultured hippocampal  neurons to determine how disruptions of Arp2/3 complex regulation affect spine dynamic behavior and stability.  I will use GFP-­actin fluorescent recovery after photobleaching (FRAP), employing the approaches used by my  collaborator, with the same mutant cohort to determine how these proteins impact spine stability via control of  the stable and dynamic actin pools.

项目摘要   树突状的脊柱稳定性在精神病和神经系统疾病中被禁用。树突状的刺丰富 高度分支的细胞骨架，包含稳定和动态的丝状肌动蛋白库和单体肌动蛋白。 ABL2/ARG非受体酪氨酸激酶（ARG）及其相互作用伴侣Cortactin的丧失。 在青少年晚期引起宽度脊柱损失，但是这两种蛋白质的机制 树突状脊柱稳定性仍然难以捉摸。我们的实验室最近使用了总内反射显微镜显示 （TIRFM）基于单丝的测定，ARG和Cortactin协同调节ARP2/3介导的肌动蛋白 分枝。通过ARG和Cortactin对ARP2/3复合物的协调调节是合理的机制 这些蛋白质支持脊柱稳定性。在我的研究计划中，我将检验ARG和Cortactin的假设 通过调节ARP2/3复合物和脊柱维护来赋予树突状脊柱稳定性 稳定的肌动蛋白池。 目标1。确定ARG如何与Cortactin和Arp2/3复合物相互作用以促进肌动蛋白分支 成核。它仍然无法解决ARG如何调节ARP2/3复合物以及Cortactin如何与 arg旨在增强这种效果。为了解决Arg如何调节综合体，我将学习如何进行功能 基于TIRFM单丝测定法来定义ARG的最小域，足以激活ARP2/3 复杂的。我的初步数据指示ARG可以直接结合ARP2/3复合物。我将扩大这些约束力 测定并学习如何进行化学交联实验以确定（1）最小的ARG片段 这可以与ARP2/3复合物和（2）通过的高亲和力相互作用 ARG与ARP2/3复合物相互作用，尤其是。最后，我将开发两种方法来确定Cortactin如何 可以与ARD坐标以刺激ARP2/3激活。两色单分子TIRF测定法会解决 cortactin招募分支点和竞争结合测定法会确定Cortactin功能是否功能 （机械上的）从新生的分支点释放Arg，从而允许灯丝伸长。 目标2。确定ARG和Cortactin调节脊柱稳定性的机制。 arg，， cortactin和Arp2/3复合物浓缩在树突状棘中，每一种都需要脊柱稳定性， 但是他们如何互动以赋予这种稳定性是不理解的。实验室收集的初步数据表明 皮质素的丧失最初会在树突状脊柱不稳定之前降低稳定的F-肌动蛋白。使用定义明确的ARG或 cortactin突变体，我将在培养的海马中执行敲低/互补和共聚焦显微镜 神经元确定ARP2/3复杂法规的破坏如何影响脊柱动态行为和稳定性。 我将使用我的GFP-肌动蛋白荧光恢复（FRAP），采用我的方法 合作者，具有相同的突变队列，以确定这些蛋白如何通过控制 稳定而动态的肌动蛋白池。