High-Throughput Assays for Inhibitors of Understudied Bacterial Proteases

正在研究的细菌蛋白酶抑制剂的高通量测定

基本信息

  • 批准号:
    9321116
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 29.26万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2015
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2015-08-01 至 2018-12-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

DESCRIPTION (provided by applicant): High-Throughput Assays for Inhibitors of Understudied Bacterial Proteases Bacteria that colonize the human mucosa can become virulent and invasive, causing chronic and acute diseases including drug-resistant gonorrhea, pneumonia, and meningitis. New drugs targeting colonization and invasion would be welcome additions to the antibacterial arsenal, but interactions among bacterial factors, host tissues, and host immune defenses are poorly understood. For instance, immunoglobulin A1 (IgA1) represents an important barrier to colonization of mucosal surfaces, and pathogenic strains of several Gram- positive and Gram-negative bacteria produce proteases that cleave IgA1. These include Neisserial, Haemophilus, and Streptococcus strains that cause chronic ear infections (otitis media), bronchitis, drug- resistant gonorrhea, bacterial pneumonia and bacterial meningitis. Despite a large body of evidence that IgAPs are virulence factors with diverse functions, they have been vastly understudied because there were few assays for measuring their activity and no selective inhibitors. Importantly, the potential for targeting IgAPs as an ani-virulence therapy remains untested, and will remain so until selective inhibitors are identified. The Kritzer lab uses synthesis, biophysical chemistry, and cell biology to develop inhibitors of difficult-to-target proteins. Recently, we designed fluorescence probes to quantitate IgAP activity from diverse human pathogens. Despite forty years of research into IgAP biology, these probes are the first and only of their kind and enable the first-ever high-throughput screens for IgAP inhibitors. The goal of this R01 proposal is to leverage these probes into high-throughput screens that will deliver selective inhibitors of IgAPs. We will accomplish this goal by: testing additional substrate sequences, developing the substrates into fluorescent probes, incorporating the probes into HTS assays for IgAP inhibitors, performing pilot screens, and testing hits in follow-up assays that measure their effects in vitro and on live bacteria. We have partnered with the Broad Institute to ensure smooth transitions from probe development to pilot assays to a full screening campaign. The assays developed in this project will be of general use to microbiologists and immunologists for quantifying IgAP activity. They could also find clinical applications in the diagnosis of bacterial meningitis and other infections. Most importantly, the inhibitors developed from high-throughput screening will allow us and others to investigate host-pathogen interactions involving IgAPs. The inhibitors will also represent starting points for evaluating IgAPs as drug targets for treating urgent infectious disease threats, including drug- resistant gonorrhea, bacterial pneumonia, and bacterial meningitis.
描述(由申请人提供):正在研究的细菌蛋白酶抑制剂的高通量测定定植于人类粘膜的细菌可能变得有毒并具有侵袭性,引起慢性和急性疾病,包括耐药性淋病、肺炎和脑膜炎。针对定植和入侵的新药将是抗菌库中受欢迎的补充,但细菌因素、宿主组织和细菌之间的相互作用 人们对宿主免疫防御知之甚少。例如,免疫球蛋白 A1 (IgA1) 是粘膜表面定植的重要屏障,几种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的致病菌株会产生裂解 IgA1 的蛋白酶。这些包括引起慢性耳部感染(中耳炎)、支气管炎、耐药性淋病、细菌性肺炎和细菌性脑膜炎的奈瑟氏球菌、嗜血杆菌和链球菌菌株。尽管大量证据表明 IgAP 是具有多种功能的毒力因子,但由于很少有测量其活性的测定方法且没有选择性抑制剂,因此对它们的研究还很不足。重要的是,靶向 IgAP 作为抗毒力疗法的潜力尚未经过测试,并且在确定选择性抑制剂之前仍将如此。 Kritzer 实验室利用合成、生物物理化学和细胞生物学来开发难以靶向的蛋白质的抑制剂。最近,我们设计了荧光探针来定量 IgAP 活性 来自不同的人类病原体。尽管对 IgAP 生物学进行了四十年的研究,但这些探针是同类中第一个也是唯一一个,并且能够首次实现 IgAP 抑制剂的高通量筛选。 R01 提案的目标是利用这些探针进行高通量筛选,从而提供 IgAP 的选择性抑制剂。我们将通过以下方式实现这一目标:测试额外的底物序列,将底物开发成荧光探针,将探针纳入 IgAP 抑制剂的 HTS 测定中,进行试点筛选,并在后续测定中测试命中,以测量其体外和活体内的效果细菌。我们与布罗德研究所合作,确保从探针开发到试点检测再到全面筛选活动的顺利过渡。该项目开发的检测方法将普遍用于微生物学家和免疫学家量化 IgAP 活性。他们还可以在细菌性脑膜炎和其他感染的诊断中找到临床应用。最重要的是,通过高通量筛选开发的抑制剂将使我们和其他人能够研究涉及 IgAP 的宿主-病原体相互作用。这些抑制剂还将成为评估 IgAP 作为治疗紧急传染病威胁(包括耐药性淋病、细菌性肺炎和细菌性脑膜炎)的药物靶点的起点。

项目成果

期刊论文数量(2)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Emerging Methods and Design Principles for Cell-Penetrant Peptides.
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