Active Site Models of CYP4 Enzymes

CYP4酶的活性位点模型

基本信息

  • 批准号:
    7337978
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 30.42万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    1994
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    1994-04-01 至 2010-12-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

The long term aim of the research described in this proposal is to understand the structural basis for the unique substrate specificities of the human cytochrome P450 family 4 enzymes. CYP4A and 4F enzymes play important roles in the thermodynamically disfavored co-oxidation of endogenous fatty acids such as arachidonic acid and the leukotrienes. Versatile CYP4B enzymes, which are the focus of this proposal, are associated with the bioactivation of a diverse array of pro-toxins including carcinogenic aromatic amines and pneumotoxic furans, while also maintaining to-hydroxylase selectivity for fatty acids and alkyl hydrocarbons. The latter activity may be associated with, as yet, unknown physiological substrate(s) for the enzyme. Human CYP4B1, on the other hand, is an enigmatic enzyme that may have its catalytic function compromised by unique coding region sequences relative to animal forms of the enzyme. These substantial species-differences in metabolism complicate risk assessment in humans for CYP4B1-dependent bioactivation of pro-toxins. To directly address the catalytic function of CYP4B1, and to accommodate the difficulties inherent in working with the human form of the enzyme in heterologous expression systems, we will develop knockout and transgenic mouse models with which to test enzyme function. Specifically, Aim 1 proposes to complete development of a CYP4b1-null mouse line which will be used in Aim 2 to determine the contribution of Cyp4b1 to arylamine induced liver and bladder toxicity. These Aims will test the hypothesis that CYP4b1, rather than CYPla2 - which has been ruled out as a causative enzyme in previous knockout experiments - is responsible for arylamine bioactivation in the mouse. Aim 3 will extend the mouse model work to develop a transgenic line carrying various versions of the human CYP4B1gene. This in vivo model is ideally suited to providing an optimal in situ environment for correct folding and heme incorporation of the human enzyme. Aims 4 and 5 propose to develop an increasingly sophisticated picture of the CYP4B1 active site. In Aim 4. we will exploit tight binding of hydrocarbons to CYP4B1 to evaluate the dimensions of the active site pocket by spectrophotometric analysis. In Aim 5 we will capitalize further on this phenomenon by engineering conformationally stabilized hydrocarbon-bound, soluble, monodispersed forms of CYP4B1 suitable for crystallization. The parallel pursuits involving gene-targeted mice and the two-tiered approach to mapping the enzyme's active site are complementary to our overarching goal of understanding structure-function relationships for CYP4B1 at the molecular level.
本提案中描述的研究的长期目标是了解 人类细胞色素 P450 家族 4 酶的独特底物特异性。 CYP4A 和 4F 酶 在内源性脂肪酸的热力学不利共氧化中发挥重要作用,例如 花生四烯酸和白三烯。本提案的重点是多功能 CYP4B 酶, 与多种原毒素的生物激活有关,包括致癌芳香胺和 具有肺毒性的呋喃,同时还保持对脂肪酸和烷基烃的羟化酶选择性。 后一种活性可能与迄今为止未知的酶生理底物有关。 另一方面,人类 CYP4B1 是一种神秘的酶,可能具有催化功能 受到与酶的动物形式相关的独特编码区序列的影响。这些实质性的 新陈代谢的物种差异使人类 CYP4B1 依赖性风险评估变得复杂 原毒素的生物活化。 直接解决CYP4B1的催化功能,并解决工作中固有的困难 利用异源表达系统中的人类形式的酶,我们将开发敲除和 用于测试酶功能的转基因小鼠模型。具体来说,目标 1 建议完成 开发 CYP4b1 缺失小鼠品系,将其用于目标 2 以确定 Cyp4b1 与芳基胺诱导肝脏和膀胱毒性。这些目标将检验 CYP4b1、 而不是 CYPla2(在之前的敲除实验中已被排除为致病酶)是 负责小鼠中芳基胺的生物激活。目标 3 将扩展小鼠模型工作以开发 携带各种版本的人类 CYP4B1 基因的转基因系。该体内模型非常适合 为人类酶的正确折叠和血红素掺入提供最佳的原位环境。 目标 4 和 5 建议开发一幅日益复杂的 CYP4B1 活性位点图。在目标 4 中。 我们将利用碳氢化合物与 CYP4B1 的紧密结合来评估活性位点口袋的尺寸 通过分光光度分析。在目标 5 中,我们将通过工程进一步利用这一现象 构象稳定的碳氢化合物结合、可溶、单分散形式的 CYP4B1 适用于 结晶。 涉及基因靶向小鼠的并行追求和绘制酶图谱的两层方法 活性位点与我们理解结构与功能关系的总体目标是互补的 分子水平上的CYP4B1。

项目成果

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