PROTEOMICS OF TOLL-LIKE RECEPTOR 2 & INTRACELLULAR FACTOR XIIIA IN PLATELETS

Toll 样受体 2 的蛋白质组学

基本信息

  • 批准号:
    8170899
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.4万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2010
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2010-06-01 至 2011-05-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

This subproject is one of many research subprojects utilizing the resources provided by a Center grant funded by NIH/NCRR. The subproject and investigator (PI) may have received primary funding from another NIH source, and thus could be represented in other CRISP entries. The institution listed is for the Center, which is not necessarily the institution for the investigator. Beside hemostasis, platelets are known to play a role in immune responses and inflammatory processes. Interaction with pathogens involves pathogen recognition, release of granule-content, and cytoskeletal rearrangements in the platelet. We have identified the expression of toll-like receptors (TLR) on the platelet surface, supporting a role for the platelet in innate immune responses. In addition, the TLR pathway links inflammation to atherosclerosis, as TLRs are expressed in atherosclerotic plaques and murine TLR2 stimulation causes enhanced atherosclerosis. Intracellular Factor XIIIA (FXIIIA) can crosslink platelet cytoskeletal proteins upon platelet activation. Relevant to the immune response, FXIIIA is required for cytoskeletal remodeling during monocyte phagocytosis, but its role in platelet-mediated immune processes is unknown. We have applied a proteomics approach to search for TLR2- and FXIIIA-associated proteins in resting platelets. After immunoprecipitation (IP) of TLR2 and FXIIIA from platelet lysates followed by gel separation, protein bands were excised, digested with trypsin and analysed by mass spectrometry. Western blot analysis was applied to confirm the mass spectrometric results. We repeatedly immunoprecipitated FXIIIA directly with TLR2-specific antibodies, whereas the IP of FXIIIA pulled down a truncated form of TLR2, as identified by Western blot, that may correspond to the soluble form of TLR2. By mass spectrometry, we identified FXIIIA and FXIIIA-associated proteins: thrombospondin, filamin and talin. Importantly, talin has not been previously reported as FXIII-substrate or associated protein. Thrombospondin, a known FXIII substrate, is stored in platelet granules. A strong thrombospondin-band after FXIIIA-IP and a weak band after TLR2-IP suggests the partial presence of FXIIIA and soluble TLR2 in granules. Interestingly, FXIIIA appears to be associated with its substrates in the resting platelet. In conclusion, our results indicate the presence of known and novel FXIIIA-associated proteins in platelets and suggests a role for TLR2 and FXIIIA in platelet-dependent immune responses. A manuscript reporting these results was published in Thrombosis and Hemostasis (S Rex et al., Immune versus thrombotic stimulation of platelets differentially regulatessignalling pathways, intracellular protein-protein interactions, and alpha-granule release.Thromb Haemost. 2009, 102, 97-110 ).
该子项目是利用该技术的众多研究子项目之一 资源由 NIH/NCRR 资助的中心拨款提供。子项目及 研究者 (PI) 可能已从 NIH 的另一个来源获得主要资金, 因此可以在其他 CRISP 条目中表示。列出的机构是 对于中心来说,它不一定是研究者的机构。 除了止血之外,已知血小板还在免疫反应和炎症过程中发挥作用。与病原体的相互作用涉及病原体识别、颗粒内容物的释放以及血小板中的细胞骨架重排。我们已经确定了血小板表面 Toll 样受体 (TLR) 的表达,支持血小板在先天免疫反应中的作用。此外,TLR 通路将炎症与动脉粥样硬化联系起来,因为 TLR 在动脉粥样硬化斑块中表达,而小鼠 TLR2 刺激会导致动脉粥样硬化加剧。细胞内因子 XIIIA (FXIIIA) 可以在血小板激活时交联血小板细胞骨架蛋白。与免疫反应相关,单核细胞吞噬过程中细胞骨架重塑需要 FXIIIA,但其在血小板介导的免疫过程中的作用尚不清楚。我们应用蛋白质组学方法在静息血小板中寻找 TLR2 和 FXIIIA 相关蛋白。对血小板裂解物中的 TLR2 和 FXIIIA 进行免疫沉淀 (IP),然后进行凝胶分离,然后切除蛋白条带,用胰蛋白酶消化并进行质谱分析。应用蛋白质印迹分析来确认质谱结果。我们重复使用 TLR2 特异性抗体直接免疫沉淀 FXIIIA,而 FXIIIA 的 IP 则拉下截短形式的 TLR2(经蛋白质印迹鉴定),这可能对应于 TLR2 的可溶形式。通过质谱分析,我们鉴定了 FXIIIA 和 FXIIIA 相关蛋白:血小板反应蛋白、细丝蛋白和 talin。重要的是,talin 此前并未被报道为 FXIII 底物或相关蛋白。血小板反应蛋白是一种已知的 FXIII 底物,储存在血小板颗粒中。 FXIIIA-IP 后的强血小板反应蛋白带和 TLR2-IP 后的弱带表明颗粒中部分存在 FXIIIA 和可溶性 TLR2。有趣的是,FXIIIA 似乎与其静息血小板中的底物相关。总之,我们的结果表明血小板中存在已知和新型 FXIIIA 相关蛋白,并表明 TLR2 和 FXIIIA 在血小板依赖性免疫反应中的作用。报告这些结果的手稿发表在 Thrombosis and Hemostasis 杂志上(S Rex 等人,血小板的免疫与血栓刺激差异调节信号通路、细胞内蛋白质-蛋白质相互作用和 α 颗粒释放。Thromb Haemost. 2009, 102, 97-110 )。

项目成果

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