MECHANISMS OF MAMMALIAN DNA REPAIR

哺乳动物 DNA 修复机制

基本信息

  • 批准号:
    2733101
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 10.49万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    1995
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    1995-07-01 至 2000-06-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

cis-Diamminedichloroplatinum(II) (cis-DDP) is a widely prescribed chemotherapeutic drug used to treat a variety of malignancies. A major limitation of cis-DDP treatment is recurrence and subsequent resistance. Resistance to cis-DDP treatment is, in part, a result of the ability to repair cis-DDP-DNA adducts. Understanding the basic mechanism of cis-DDP repair and the regulation of repair specific protein expression is essential to identify how cis-DDP resistance occurs and to develop effective therapies. Therefore, our goal is to determine the enzymatic pathway responsible for the repair of cis-DDP DNA adducts. Our approach is to purify proteins from mammalian cells, which are likely to be involved in repair of cis-DDP-DNA adducts based on their affinity for cis-DDP damaged DNA. These include human helicase E, damage recognition proteins (DRPs), a recently identified DNA dependent ATPase and damage incision proteins (DIPs). Extensive characterization of the individual proteins will be performed with a focus on how they interact with cis-DDP damaged DNA. DRPs and DIPs will also be characterized with respect to specificity for different types of DNA damage. Specifically, their binding and incision activities will be tested on thymine dimers, psoralen, 2-aminofluorine and cc1065 DNA adducts. Characterization of helicase E includes activity on cis-DDP and UV damaged DNA substrates and the ability to form a functional complex with DNA polymerase epsilon to perform repair synthesis. The effect of DRPs bound to damaged DNA on helicase activity will also be assessed. Initial characterization of ATPase-I will include determining if other DNA metabolizing activities, specifically helicase, ligase or nuclease, are associated with ATPase-I activity. In addition, the activity of ATPase-I will be assessed using a variety of synthetic DNA substrates designed to mimic structures found in DNA replication and repair. ATPase-I activity will also be measured using UV and cis-DDP damage DNA substrates. The effect of DRPs bound to damaged DNA on ATPase-I activity will also be evaluated to assess how the proteins interact. Antibodies will be raised against the two DRPs and ATPase-I and used to assess the role of each protein in an in vitro DNA repair assay and a Xenopus ooyte excision repair system. The level of expression of these proteins will be assessed in cis-DDP resistant and sensitive cell lines and XP cells. Immunoaffinity purification protocols will be established to aid in the purification of these proteins from cis-DDP resistant cell lines and XP cells, which will then allow direct comparison of the activities from the different cell lines.
顺式 - 二手氯铂(II)(顺式DDP)是广泛规定的 用于治疗各种恶性肿瘤的化学治疗药物。专业 顺式DDP处理的局限性是复发和随后的耐药性。 对顺式DDP治疗的抗性部分是由于能力 修复顺式DDP-DNA加合物。了解顺式DDP的基本机制 修复和修复特异性蛋白表达的调节是 确定CIS-DDP抗性的情况至关重要 有效的疗法。因此,我们的目标是确定酶促 负责修复顺式DDP DNA加合物的途径。我们的方法是 从哺乳动物细胞中纯化蛋白质,可能涉及 在CIS-DDP-DNA加合物的修复基于其对顺式DDP的亲和力 受损的DNA。这些包括人类解旋酶E,损伤识别蛋白 (DRP),最近确定的DNA依赖性ATPase和损伤切口 蛋白质(蘸酱)。 将执行各个蛋白质的广泛表征 侧重于它们与顺式DDP损坏的DNA的相互作用。 DRP和DIPS 还将在不同类型的特异性方面进行特征 DNA损伤。具体而言,它们的约束和切口活动将是 在胸腺二聚体,牛cor,2-氨基氟和CC1065 DNA上测试 加合物。解旋酶E的表征包括对顺式DDP和 紫外线损坏的DNA底物和形成功能复合物的能力 用DNA聚合酶epsilon进行修复合成。效果 在解旋酶活性上与受损DNA受损的DRP也将被评估。 ATPase-I的初始表征将包括确定其他DNA是否 代谢活性,特别是解旋酶,连接酶或核酸酶是 与ATPase-I活性相关。另外,ATPase-I的活性 将使用设计为 在DNA复制和修复中发现的模拟结构。 ATPase-I活性 还将使用UV和CIS-DDP损伤DNA底物测量。这 DRP与受损DNA的影响对ATPase-I活性的影响也将是 评估以评估蛋白质的相互作用。 抗体将针对两个DRP和ATPase-I产生,并用于 评估每种蛋白在体外DNA修复测定和A中的作用 Xenopus Ooyte切除修复系统。这些表达水平 蛋白质将在CIS-DDP和敏感细胞系中进行评估 和XP细胞。免疫亲和力净化方案将建立 有助于从顺式DDP细胞中纯化这些蛋白质 线和XP单元,然后将直接比较 来自不同细胞系的活动。

项目成果

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