逆遺伝学的手法に基づく脊索動物ホヤの卵後極に局在する母性ｍＲＮＡの局在機構の解明

基于反向遗传学方法阐明脊索动物海鞘卵后极母体mRNA定位机制

基本信息

批准号：
13J00554
负责人：
飯塚貴子
金额：
$ 1.34万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

初期発生における細胞分化や運命決定は母性因子による制御を受けている。そのため、母性因子機能の理解が初期発生機構の解明に必須である。私はカタユウレイボヤ卵において、将来の後方を形成する領域に特異的に局在する母性mRNAに着目し、その局在機構の解明を進めている。具体的には、母性mRNAを特異的に発現抑制する遺伝子組換え系統作製の技術(MASK法）を利用して、母性mRNAの局在機構を制御するRNA結合タンパク質の同定を進めている。前年度に選出した4種の遺伝子の発現抑制系統を作成した。そのうちの2種の遺伝子、Ci-HNRNPDとCi-RBM15/19の発現抑制系統から卵が得た。その卵でin situ hybridization法を用いて局在母性mRNAの発現パターンを検証した。その結果、これらの2系統ではCi-POPK1とCi-pem3 mRNAの卵の後方への局在が失われたが、その一方で卵全体での発現には顕著な変化が生じなかった。このことから、Ci-HNRNPD遺伝子とCi-RBM15/19遺伝子はCi-POPK1及びCi-pem3 mRNAの局在機構に関与している可能性が高いが、その発現機構には影響したいことを解明した。前年度に引き続き、MASK法において母性mRNAの発現抑制が生じるメカニズムを検証した。母性因子の一種であるCi-NutとCi-pem mRNAの発現抑制系統の卵巣で作られるsmall RNAの発現比較を、RNA seq法により行った。その結果、Ci-NutとCi-pemの発現抑制系統のどちらも5’UTR及び、その付近のターゲットのプロモーター領域由来のアンチセンスsmall RNAが顕著に多く作られていた。ことからこの5’UTR及び、その近辺から作られるアンチセンスsmall RNAが母性mRNAの発現抑制を引き起こしている可能性が極めて高いことを解明した。

早期发育过程中的细胞分化和命运决定受母体因素控制。因此，了解母体因素的功能对于阐明早期发育机制至关重要。在玻璃海鞘卵中，我重点关注专门定位于未来后部区域的母体 mRNA，并致力于阐明其定位机制。具体来说，我们正在通过使用技术创建特异性抑制母体 mRNA 表达的基因工程菌株（MASK 方法）来鉴定控制母体 mRNA 定位机制的 RNA 结合蛋白。我们为前一年选择的四个基因创建了表达抑制系。卵是从其中两个基因 Ci-HNRNPD 和 Ci-RBM15/19 表达受到抑制的品系中获得的。使用原位杂交方法验证了鸡蛋中局部母体 mRNA 的表达模式。结果，在这两个品系中，Ci-POPK1 和 Ci-pem3 mRNA 在卵后部的定位丢失，但整个卵的表达没有显着变化。由此，我们阐明Ci-HNRNPD基因和Ci-RBM15/19基因很可能参与Ci-POPK1和Ci-pem3 mRNA的定位机制，但它们不想影响表达机制。继去年之后，我们利用MASK法验证了母体mRNA表达抑制的机制。我们使用 RNA seq 比较了 Ci-Nut（一种母体因子）和 Ci-pem mRNA 表达抑制系的卵巢中产生的小 RNA 的表达。结果，Ci-Nut 和 Ci-pem 表达抑制系均产生显着更多的源自 5'UTR 及其附近靶启动子区域的反义小 RNA。这表明从该5'UTR及其附近产生的反义小RNA极有可能导致母体mRNA表达的抑制。