コレラ菌の鉄代謝機構の解明とその阻害による創薬への応用

阐明霍乱弧菌的铁代谢机制及其抑制药物发现

• 批准号: 13J04076
• 负责人: 関根 由可里
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J04076/
• 关键词: ヘム; ヘム輸送タンパク質; ヘム分解酵素; 相互作用; X線結晶構造解析; 共鳴ラマン分光法; 表面プラズモン共鳴; ヘム輸送体; 紫外可視吸収分光法; ラマン分光法; ヘム蛋白質; 反応機構; 反応中間体; 酸素活性化; 共鳴ラマン; 結晶構造解析

昨年までの研究により、HutZ がヘム分解酵素であり、ヘムの周辺構造が酵素活性を制御していることが明らかになったが、 HutZ がどのように基質であるヘムを獲得するかは不明であった。そこで、hutZ 周辺遺伝子を探索したところ、hutX が hutZ とオペロンを形成しており、遺伝子解析により HutX はヘム輸送蛋白質と予測された。そこで本年度は、 HutX によるヘム輸送および HutZ 活性化能を検討した。HutX のヘム輸送蛋白質としてのヘム結合様式を検討するため、ヘム滴定を行ったところ、HutX とヘムは 1:1 で結合し、X 線結晶構造解析と共鳴ラマン分光法から、ヘムは Tyr90 に配位することが明らかとなった。しかし、 HutXのヘム解離定数Kdは7.4 nMと見積もられ、これはHutZのKdと同程度であることから、Kdの値の比較 からは HutZ へのヘム輸送は確認できなかった。そこで、HutX のヘム結合体と HutZ を混合させ、その紫外可視 吸収スペクトルの変化を追跡したところ、極大吸収波長がHutXのヘム由来の390 nmからHutZのヘム由来の 412 nm に変化し、ヘムが HutX から HutZ へ輸送されることが確認され、表面プラズモン共鳴の結果から、HutX と HutZ は相互作用し、ヘムの輸送を行っていることが明らかとなった。そこで、過酸化水素添加による HutZ の ヘム分解活性を測定してみると、HutX から HutZ に輸送されたヘムも分解された。以上のことから、HutX は HutZ と相互作用し、ヘムを受け渡すヘム輸送蛋白質であることが明らかとなった。

截至去年的研究表明，HutZ 是一种血红素降解酶，血红素的周围结构控制着酶的活性，但尚不清楚 HutZ 如何获得底物血红素。因此，我们寻找hutZ周围的基因，发现hutX与hutZ形成操纵子，并且遗传分析预测HutX是血红素转运蛋白。因此，今年我们研究了 HutX 的血红素转运和 HutZ 激活能力。为了研究HutX作为血红素转运蛋白的血红素结合模式，我们进行了血红素滴定，发现HutX和血红素以1:1的比例结合，X射线晶体学和共振拉曼光谱显示血红素位于Tyr90。很明显，然而，HutX 的血红素解离常数 Kd 估计为 7.4 nM，与 HutZ 的 Kd 相当，因此无法通过比较 Kd 值来确认血红素向 HutZ 的转运。因此，当我们将HutX的血红素缀合物与HutZ混合并跟踪其紫外-可见吸收光谱的变化时，我们发现最大吸收波长从来自HutX血红素的390 nm变为412 nm，这是由HutX的血红素衍生的。从HutZ的血红素来看，表明血红素是HutX被转运到HutZ的，并且从表面等离子体共振结果来看，HutX和HutZ据透露，两者相互作用并运输血红素。因此，当我们通过添加过氧化氢来测量HutZ的血红素分解活性时，我们发现从HutX转运到HutZ的血红素也被降解。由上可知，HutX是与HutZ相互作用并转运血红素的血红素转运蛋白。

项目成果

コレラ菌ヘム分解系における還元酵素の同定および機能・構造解析

霍乱弧菌血红素分解系统还原酶的鉴定及功能/结构分析

• 发表时间: 2013
• 作者: 関根由可里;石森浩一郎;内田毅
• 通讯作者: 内田毅

Cytoplasmic Heme-Binding Protein (HutX) from Vibrio cholerae Is an Intracellular Heme Transport Protein for the Heme-Degrading Enzyme, HutZ

来自霍乱弧菌的细胞质血红素结合蛋白 (HutX) 是血红素降解酶 HutZ 的细胞内血红素转运蛋白

• DOI: 10.1021/acs.biochem.5b01273
• 发表时间: 2016
• 影响因子: 2.9
• 作者: Yukari Sekine; Takehito Tanzawa; Yoshikazu Tanaka; Koichiro Ishimori;Takeshi Uchida
• 通讯作者: Takeshi Uchida

コレラ菌由来ヘム分解酵素HutZにおける反応機構と活性制御機構の解明

阐明霍乱弧菌血红素降解酶HutZ的反应机制和活性控制机制

• 发表时间: 2013
• 作者: 関根由可里;石森浩一郎;内田毅
• 通讯作者: 内田毅

コレラ菌由来ヘム分解酵素HutZの活性中心近傍に存在する水素結合による機能制御

霍乱弧菌血红素降解酶 HutZ 活性中心附近氢键的功能调节

• 发表时间: 2013
• 作者: 関根由可里;松井敏高;齋藤正男;石森浩一郎;内田毅
• 通讯作者: 内田毅

コレラ菌由来HutZにおけるヘム分解活性制御機構

霍乱弧菌HutZ血红素分解活性的控制机制

• 发表时间: 2013
• 作者: 関根由可里;石森浩一郎;内田毅
• 通讯作者: 内田毅