Elucidation of aberrant ketone body metabolism in transporter polymorphisms and establishment of biomarkers

转运蛋白多态性中异常酮体代谢的阐明和生物标志物的建立

• 批准号: 22K11867
• 负责人: 青山 友佳
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Chubu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K11867/
• 关键词: 先天性ケトン体代謝異常; モノカルボン酸トランスポーター(MCT); MCT1; MCT4; ケトン体代謝; 遺伝子多型解析; 先天代謝異常症; 乳幼児突然死; モノカルボン酸トランスポーター; 先天性ケトン体代謝異常症; ケトン体; 分子栄養学

先天性ケトン体代謝異常症は、乳幼児において重篤なケトアシドーシス発作を起こす遺伝性の希少疾患である。ミトコンドリア内のケトン体代謝異常が原因とされるが発症機構は不明な点が多く、乳幼児突然死の原因になる。本研究は、重篤なケトアシドーシス発作につながるケトン体代謝異常において、その重症度の差が生じる原因としての遺伝子変異や一塩基多型が及ぼす、細胞膜とミトコンドリアにおける代謝経路でのケトン体利用の機序を解明することを目標としている。今年度は、ケトン体代謝異常症ではまだ未解明な細胞膜上のトランスポーターであるMCT1、MCT4について、遺伝子多型、タンパクの機能、ケトン体の作用機序について総合的にアプローチするための実験系を構築するため、下記の実験を進めた。①MCT1・MCT4における遺伝子解析：MCT1をコードするSLC16A1、MCT4をコードするSLC16A3遺伝子にて、各エクソンを増幅するためのプライマーの設計、遺伝子解析の条件を確立した。これら遺伝子の一塩基多型の解析を進めるにあたり低侵襲の採血が望ましいと考え、血液ろ紙への微量採血にて乾燥血液ろ紙からのDNA抽出法を確立した。②MCT1・MCT4の抽出とウエスタンブロット解析：MCT1、MCT4蛋白を得るため細胞質タンパクのコンタミネーションを抑える抽出試薬および抗体の検討を行い、ウエスタンブロットによるMCT1、MCT4蛋白の評価が可能となった。β-ケトチオラーゼ欠損症、SCOT欠損症とともにケトン体利用障害の総合的な評価につながる。③MCT1を介した乳酸の代謝とミトコンドリアでのエネルギー代謝評価：MCT1欠損細胞の細胞培養液を低グルコース環境とした条件での乳酸の取り込みとミトコンドリアでのエネルギー産生の代謝解析を行なった。MCT1欠損細胞は野生型細胞と比較し、細胞内外の乳酸濃度が高値であることが明らかとなった。

先天性酮体代谢障碍是一种罕见的遗传性疾病，会导致婴儿严重酮症酸中毒发作。它被认为是由线粒体内酮体代谢异常引起的，但发病机制很大程度上尚不清楚，它可导致婴儿猝死。本研究调查了基因突变和单核苷酸多态性对细胞膜和线粒体代谢途径中酮体利用的影响，这些影响是导致严重酮症酸中毒发作的酮体代谢异常严重程度差异的原因。的机制。今年，我们将开发一个实验系统，全面研究 MCT1 和 MCT4 的遗传多态性、蛋白质功能和酮体作用机制，MCT1 和 MCT4 是酮体代谢紊乱中仍未知的细胞膜转运蛋白。为了构建这个，我们进行了以下实验。 ①MCT1和MCT4的遗传分析：设计引物扩增各外显子，并为编码MCT1的SLC16A1和编码MCT4的SLC16A3建立基因分析条件。我们认为微创采血对于分析这些基因中的单核苷酸多态性是理想的，并且我们通过在血液滤纸上收集少量血液，建立了从干燥的血液滤纸中提取DNA的方法。 ② MCT1和MCT4的提取和Western blot分析：为了获得MCT1和MCT4蛋白，我们研究了抑制细胞质蛋白污染的提取试剂和抗体，使得通过Western blot评价MCT1和MCT4蛋白成为可能。与β-酮硫解酶缺乏和SCOT缺乏一起，导致酮体利用障碍的综合评估。 (3)MCT1介导的乳酸代谢和线粒体能量代谢的评价：在低葡萄糖环境下，在MCT1缺陷细胞的细胞培养基中进行乳酸摄取和线粒体能量产生的代谢分析。结果表明，与野生型细胞相比，MCT1 缺陷细胞具有更高的细胞内和细胞外乳酸浓度。