試験管内転写tRNAを用いた再構成型酵母翻訳系による非天然アミノ酸導入システム

使用体外转录的 tRNA 的重组酵母翻译系统的非天然氨基酸引入系统

基本信息

批准号：
22K19264
负责人：
富田野乃
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19264/
关键词：
無細胞翻訳系非天然アミノ酸酵母試験管内転写tRNA

项目摘要

本研究では、近年申請者が構築した試験管内転写tRNA(iVT tRNA)を用いた再構成型酵母翻訳系を利用し、高分子タンパク質内部に複数種類の非天然アミノ酸を同時に導入できるシステムを確立する。当該酵母翻訳系は、21種類のiVT tRNAによって構成されており、終止コドンの他、計34種類のセンスコドンがアミノ酸を指定しない空コドンとなる。これら空コドンに非天然アミノ酸を割り当てることにより、異なる種類の非天然アミノ酸をタンパク質の複数箇所に導入できる筈である。当該年度は、モデルタンパク質(nLuc)へ非天然アミノ酸を導入し、導入効率のコドン依存性、非天然アミノ酸の種類依存性、を評価した。1. 導入効率のコドン依存性の解析はじめに、UAG終止コドンと3種の空コドン(AGC、AGG、UUG)への非天然アミノ酸(D-Phe)の導入効率を解析した。D-PheはフレキシザイムによりiVT tRNACysにチャージさせた。UAG終止コドンではeRF1非存在下においてのみD-Pheを導入できた。AGG空コドンではeRF1存在下でもD-Pheを導入できた。AGCとUUG空コドンでは何らかの天然アミノ酸も誤導入されることが示された。未修飾iVT tRNAは、AGCやUUGなど特定の空コドンにおいて誤読をおこすことが明らかとなった。2. 非天然アミノ酸の種類依存性SPIEDACクリックケミストリーに対応する非天然アミノ酸TCO*Lysの導入効率を評価した。TCO*Lysはメタン生成古細菌由来PylRSを利用して　iVT tRNAPylにチャージさせた。TCO*LysはUAG終止コドンおよび、AGGや AGC、UUG空コドンにおいてeRF1存在下で導入された。従来eRF1より強く終止コドンに結合できるtRNAは知られていなかったが、tRNAPyl が極めて強いコドン結合能を有することを見出した。

在这项研究中，我们将利用申请人最近构建的体外转录tRNA（iVT tRNA）重建酵母翻译系统，建立一个可以同时将多种类型的非天然氨基酸引入聚合蛋白中的系统。酵母翻译系统由21种iVT tRNA组成，除终止密码子外，共有34种有义密码子，均为不指定氨基酸的空密码子。通过将非天然氨基酸分配给这些空密码子，应该可以将不同类型的非天然氨基酸引入蛋白质的多个位置。今年，我们将非天然氨基酸引入模型蛋白（nLuc）中，并评估了引入效率的密码子依赖性和非天然氨基酸类型的依赖性。 1.引入效率的密码子依赖性分析首先，我们分析了将非天然氨基酸(D-Phe)引入UAG终止密码子和三个空密码子(AGC、AGG和UUG)的效率。使用flexizyme将D-Phe充电至iVT tRNACys。在 UAG 终止密码子处，只有在不存在 eRF1 的情况下才能引入 D-Phe。即使存在 eRF1，也可以将 D-Phe 引入 AGG 空密码子中。研究表明，一些天然氨基酸也被错误引入到 AGC 和 UUG 空密码子中。研究表明，未经修饰的 iVT tRNA 会导致特定空密码子（例如 AGC 和 UUG）的误读。 2.对非天然氨基酸类型的依赖性评价了对应于SPIEDAC点击化学的非天然氨基酸TCO*Lys的引入效率。 TCO*Lys 使用源自产甲烷古菌的 PylRS 为 iVT tRNAPyl 充电。在 eRF1 存在的情况下，在 UAG 终止密码子以及 AGG、AGC 和 UUG 空密码子处引入 TCO*Lys。迄今为止，尚无已知的 tRNA 能够比 eRF1 更强地结合终止密码子，但我们发现 tRNAPyl 具有极强的密码子结合能力。