Modulation of Membrane Protein Dynamics by Glycan-Galectin Interaction

聚糖-半乳糖凝集素相互作用调节膜蛋白动力学

• 批准号: 22K19112
• 负责人: 樺山 一哉
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19112/
• 关键词: 糖鎖; ガレクチン; HaloTag; 膜タンパク質; 内在化; ライブセルイメージング; レクチン; 相互作用

本年度は、細胞外ドメインにHaloTagを融合した膜タンパク質を発現させるためのプラスミドを構築し、膜上での発現を確認した。現在、HaloTagを融合タンパク質の安定発現株の作製に手間取っており、再検討を実施中である。回避策として、このHaloTag発現細胞（一過性発現）に、蛍光プローブを導入した合成糖鎖を結合させたHaloTagリガンド(7糖、9糖、12糖)を添加し、合成糖鎖提示細胞を作製し評価に用いた。上記細胞に対して、ガレクチンを代表とする各種レクチンを作用させることで、糖鎖構造の異なる各HaloTag融合膜タンパク質がどのような挙動を示すか、共焦点走査型蛍光顕微鏡でイメージング解析を実施した。 解析手法には細胞内の輝点計測ならびにFRAP法、１粒子追尾法による側方拡散解析を行った。本研究で用いるHaloTagリガンドは糖鎖の数が増えるほどガレクチンへの結合能が向上することが知られており、これまでに側方拡散の制御を実証していた。今回、上記リガンドを結合させた膜タンパク質はガレクチンの存在下で、内在化にある程度の差が生じることが実証された。すなわち、ガレクチンと相互作用を示す合成糖鎖を導入した膜タンパク質の精密な内在化抑制を確認した。また、顕微鏡によるイメージング解析と併せて、フローサイトメトリーによる細胞膜タンパク質の発現量変化を測定した（一過性発現細胞株による先行的検証）。本検討は現在至適条件を確定中である。また、当研究室で合成された糖鎖結合HaloTag リガンドにはテトラメチルローダミンが導入されているため、今後フローサイトメトリーにおいてこの蛍光プローブを検出できるレーザーの導入も検討する。

今年，我们构建了表达膜蛋白的质粒，其胞外结构域融合有HaloTag，并证实了其在膜上的表达。目前，创建稳定表达 HaloTag 融合蛋白的菌株还需要时间，我们目前正在对其进行重新审查。作为解决方法，我们添加了与合成糖链结合的 HaloTag 配体（七糖、九糖、十糖），并将荧光探针引入这些 HaloTag 表达细胞（瞬时表达），并制备并用于合成糖链呈递细胞。评估。通过将包括半乳糖凝集素在内的各种凝集素应用于上述细胞，我们使用共聚焦扫描荧光显微镜进行成像分析，以确定具有不同糖链结构的每种 HaloTag 融合膜蛋白的行为。 分析方法包括细胞内亮点测量、FRAP方法和使用单粒子追踪方法的横向扩散分析。众所周知，本研究中使用的 HaloTag 配体与半乳糖凝集素结合的能力随着糖链数量的增加而提高，并且先前已证明了横向扩散的控制。这次，证明了与上述配体结合的膜蛋白在半乳糖凝集素存在的情况下表现出内化的一些差异。换句话说，我们确认了导入了与半乳糖凝集素相互作用的合成糖链的膜蛋白的内化被精确地抑制。除了使用显微镜进行成像分析外，还通过流式细胞术测量细胞膜蛋白表达水平的变化（使用瞬时表达细胞系进行初步验证）。这项研究目前正在确定最佳条件。此外，由于我们实验室合成的聚糖连接的HaloTag配体中已引入四甲基罗丹明，因此我们未来还将考虑引入可以在流式细胞术中检测这种荧光探针的激光。

项目成果

Reactive oxygen species are associated with the inhibitory effect ofN-(4-hydroxyphenyl)-retinamide on the entry of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2

活性氧与<i>N</i>-(4-羟苯基)-视黄酰胺对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的进入的抑制作用有关

• DOI: 10.1093/jb/mvad020
• 发表时间: 2023
• 作者: Hayashi Yasuhiro;Huang Xuhao;Tanikawa Takashi;Tanigawa Kazunari;Yamamoto Mizuki;Gohda Jin;Inoue Jun;Fukase Koichi;Kabayama Kazuya
• 通讯作者: Kabayama Kazuya

Limonoids with anti-inflammatory activity: A review

具有抗炎活性的柠檬苦素：综述

• DOI: 10.1016/j.phytochem.2022.113469
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 3.8
• 作者: Hilmayanti Erina;Nurlelasari;Supratman Unang;Kabayama Kazuya;Shimoyama Atsushi;Fukase Koichi
• 通讯作者: Fukase Koichi

Astatine-211-Labeled Gold Nanoparticles for Targeted Alpha-Particle Therapy via Intravenous Injection

砹 211 标记的金纳米颗粒用于静脉注射靶向 α 粒子治疗

• DOI: 10.3390/pharmaceutics14122705
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 5.4
• 作者: Huang Xuhao;Kaneda;Kadonaga Yuichiro;Kabayama Kazuya;Shimoyama Atsushi;Ooe Kazuhiro;Kato Hiroki;Toyoshima Atsushi;Shinohara Atsushi;Haba Hiromitsu;Wang Yang;Fukase Koichi
• 通讯作者: Fukase Koichi

合成糖鎖を生やした細胞で観る膜分子の動態

在具有合成糖链的细胞中观察到的膜分子动力学

• 发表时间: 2022
• 作者: 三浦彩音;樺山一哉;真鍋良幸;三宅秀斗;白川明日香;初村洋紀;山地俊之;鈴木健一;深瀬浩一
• 通讯作者: 深瀬浩一

FRAP法を用いたフェンレチニドによる膜流動性変化の解析

使用 FRAP 方法分析芬维A胺引起的膜流动性变化

• 发表时间: 2022
• 作者: 黄栩昊;樺山一哉;林康宏;深瀬浩一
• 通讯作者: 深瀬浩一