分裂酵母複製開始因子の分離

裂殖酵母复制起始因子的分离

基本信息

批准号：
08680744
负责人：
升方久夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680744/
关键词：
分裂酵母複製開始点自律複製配列複製開始因子

项目摘要

1.分裂酵母第2染色体から分離した自律複製断片(ARS)のうち、3つが染色体上でも複製開始点として機能することを二次元ゲル電気泳動法による複製中間体の解析により示した。2.染色体上でもプラスミド状態でも、ほぼすべての細胞周期で複製開始するARS2004を用いて複製開始必須領域を解析した。(1)940bpのARS2004の複製に必須な領域I(40bp),II(120bp),III(80bp)を同定した。(2)リンカースキャン法による置換変異の解析からアデニンストレッチが複製に必須であることを示した。(3)3つの必須領域のそれぞれ或いは全てを、polyA配列で置換えたものは機能するがpoly(AT)で置き換えたものは機能しないことから、アデニンストレッチは二重鎖を開裂しやすい性質よりも蛋白質の結合配列として機能する可能性が示唆された。(4)アデニンストレッチ(40bp)と領域II,IIIのみをベクターに挿入したものが複製能を持つことから、これらの配列が複製開始に必要充分であることを示した。アデニンストレッチを基本形とする配列が繰り返し存在する構造が分裂酵母複製開始点の特徴であり、この様な構造は出芽酵母とは大きく異なるものである。3.出芽酵母複製開始必須配列に結合し複製開始因子の候補であるORC(origin recognition complex)の分裂酵母におけるホモログ、orp1,orp2遺伝子にtagを組み込んだ融合遺伝子を発現誘導し、免疫沈降法によりこれらの遺伝子産物が相互作用することを検出した。4.分裂酵母複製必須配列とorp1,orp2蛋白との相互作用を検出する実験系を検討中である。

1.通过二维凝胶电泳对复制中间体进行分析表明，从裂殖酵母2号染色体中分离出的三个自主复制片段(ARS)充当染色体上的复制起点。 2.我们使用ARS2004分析了复制起始的关键区域，该区域在几乎所有细胞周期中启动复制，无论是在染色体上还是在质粒状态下。 (1) 鉴定了 940bp ARS2004 复制所必需的区域 I (40bp)、II (120bp) 和 III (80bp)。 (2) 使用接头扫描对取代突变进行分析表明，腺嘌呤延伸对于复制至关重要。 (3)用polyA序列替换三个必需区域中的每一个或全部起作用，但用poly(AT)替换则不起作用，这表明它可能充当蛋白质的结合序列。 (4)仅插入腺嘌呤片段(40bp)和区域II和III的载体具有复制能力，表明这些序列对于复制起始是必要且充分的。具有碱性腺嘌呤延伸的序列重复存在的结构是裂殖酵母复制起点的特征，并且该结构与芽殖酵母中的结构显着不同。 3. 我们诱导了融合基因的表达，其中插入了标签到 orp1 和 orp2 基因中，这两个基因是裂殖酵母中 ORC（起源识别复合体）的同源物，它与芽殖酵母中复制起始的必需序列结合，是一种候选复制起始因子，并使用免疫沉淀方法检测到这些基因产物相互作用。 4. 我们目前正在开发一个实验系统来检测裂殖酵母复制必需序列与orp1和orp2蛋白之间的相互作用。