細菌におけるカチオン性抗菌ペプチド検知機構の解明

阐明细菌中阳离子抗菌肽的检测机制

• 批准号: 22KJ1017
• 负责人: 西村 方博
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1017/
• 关键词: カチオン性抗菌ペプチド; ヒスチジンキナーゼ; 二成分制御系; ABC輸送体; クライオ電子顕微鏡

事前実験より、大腸菌において安定なヒスチジンキナーゼ/ABC輸送体複合体として発現されることが確認されたBacillus subtilis由来のヒスチジンキナーゼBceSおよびABC輸送体BceABについて、大スケールでの大量発現による精製方法を模索した。その結果、GFP-Nanobodyレジンを用いた、ヒスチジンキナーゼBceSに付加したGFPタグに対するアフィニティー精製が手法として適していると判断された。ここで、GFPタグはTEVプロテアーゼ切断配列を介してBceSのC末端側に付加されており、TEVプロテアーゼを用いた切断により目的産物であるBceS/BceAB複合体がGFP-Nanobodyレジンから溶出される。しかし、現状のプロトコルではタグ切断による目的産物の溶出量が構造解析には不十分であると考えられたため、プロテアーゼ切断配列の検討等によるコンストラクトの最適化、およびタグ切断に使用するプロテアーゼ量の検討等による精製手法の最適化を行った。現在コンストラクトとしてはTEVプロテアーゼによる十分なタグ切断が確認されたため、今後は引き続き精製手法の最適化を行い、構造解析に十分な量の安定なBceS/BceAB複合体を調製する精製系の確立を目指す。

通过初步实验，确认枯草芽孢杆菌来源的组氨酸激酶BceS和ABC转运蛋白BceAB在大肠杆菌中以稳定的组氨酸激酶/ABC转运蛋白复合物的形式表达，我们正在探索纯化它们的方法通过大规模的表达。结果确定，使用GFP-纳米抗体树脂对附着于组氨酸激酶BceS的GFP标签进行亲和纯化是合适的方法。此处，通过 TEV 蛋白酶裂解序列将 GFP 标签添加到 BceS 的 C 端侧，并通过使用 TEV 蛋白酶裂解从 GFP-纳米抗体树脂上洗脱所需的产物 BceS/BceAB 复合物。然而，在目前的方案中，由于标签切割而导致的目标产物的洗脱量被认为不足以进行结构分析，因此我们通过检查蛋白酶切割序列来优化构建体，并检查用于标签切割的蛋白酶的量。我们使用以下方法优化了纯化方法目前，已证实TEV蛋白酶对构建体进行了充分的标签切割，因此我们将继续优化纯化方法，旨在建立一个纯化系统，以制备足够量的稳定BceS​​/BceAB复合物用于结构分析。

项目成果

Structural insight into the tRNA-dependent bifunctional mechanism of MprF

MprF tRNA 依赖性双功能机制的结构洞察

• 发表时间: 2022
• 作者: Michihiro Nishimura; Hisato Hirano; Cameron P. Gill; Christopher N. K. Phan; Yuka Yashiro; Keitaro Yamashita; Kazuhiro Kobayashi; Yoshiaki Kise; Tsukasa Kusakizako; Yuzuru Itoh; Kozo Tomita; Herve Roy; Tomohiro Nishizawa; Osamu Nureki
• 通讯作者: Osamu Nureki