Mapping synaptic cleft proteomes by photoactivated proximity labeling

通过光激活邻近标记绘制突触裂隙蛋白质组

• 批准号: 22KJ1743
• 负责人: 高遠 美貴子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1743/
• 关键词: 近傍ラベル化法; タンパク質間相互作用; インタラクトーム; プロテオミクス; 神経伝達物質受容体

近傍ラベル化法とは、生体内環境で特定のタンパク質の周辺に存在するタンパク質を網羅的にラベル化し同定する方法である。近傍ラベル化法は未知のタンパク質間相互作用を同定する上で有用であるが、従来法は標的タンパク質に外因性酵素を遺伝子工学的に融合する必要があるため、本来のタンパク質の動態を反映しない可能性がある。そこで当研究室は遺伝子改変を必要としない光駆動の近傍ラベル化法を開発した。本手法では、標的タンパク質に小分子の光増感剤を化学修飾し、光照射によって一重項酸素を発生させることで周辺タンパク質を酸化、ラベル化する。本研究ではこの光駆動近傍ラベル化法を用いて、生きたマウス脳内に発現する神経伝達物質受容体の新規相互作用分子候補を発見することを目的とする。具体的には学習や記憶形成において重要な役割を果たすAMPA型グルタミン酸受容体や抑制性神経伝達を担うGABAA受容体などの相互作用分子を同定することを目指す。令和3年度は各標的受容体に光増感剤を修飾する化合物を合成し、実際に生きたマウス脳内で光駆動近傍ラベル化法の実験系を確立した。質量分析の結果、標的受容体との相互作用が知られているタンパク質やシナプス間隙タンパク質が複数同定され、光駆動近傍ラベル化法がin vivo適用可能であることを示した。今後は同定された個々のタンパク質と標的受容体との関係性をイメージング等の手法を用いて調査する。また、本手法を用いてAMPA型グルタミン酸受容体周辺プロテオームの時間変化を追跡することも試みる。

邻域标记法是对体内环境中特定蛋白质周围存在的蛋白质进行全面标记和识别的方法。邻域标记方法对于识别未知的蛋白质-蛋白质相互作用很有用，但常规方法需要通过基因工程将外源酶与目标蛋白质融合，因此有可能无法反映原始蛋白质的动态。因此，我们实验室开发了一种不需要基因改造的光驱动邻域标记方法。在该方法中，用小分子光敏剂对目标蛋白质进行化学修饰，通过光照射产生单线态氧来氧化和标记周围的蛋白质。本研究的目的是利用这种光驱动的邻域标记方法来发现活体小鼠大脑中表达的神经递质受体的新型候选相互作用分子。具体来说，我们的目标是识别相互作用的分子，例如在学习和记忆形成中发挥重要作用的 AMPA 型谷氨酸受体，以及在抑制性神经传递中发挥作用的 GABAA 受体。在 2021 财年，我们合成了修饰每种目标受体光敏剂的化合物，并在活体小鼠大脑中建立了光驱动邻近标记的实验系统。质谱分析的结果是，鉴定出多种已知与靶受体和突触裂蛋白相互作用的蛋白质，证明光驱动邻域标记方法适用于体内。未来，我们将利用成像和其他技术研究每个已识别的蛋白质与其靶受体之间的关系。我们还将使用这种方法来跟踪 AMPA 型谷氨酸受体周围蛋白质组的时间变化。

项目成果

Mapping a glutamate receptor interactome in living mice by photoactivated proximity labeling

通过光激活邻近标记绘制活体小鼠谷氨酸受体相互作用组图

• 发表时间: 2022
• 作者: Mikiko Takato; Hayata Utsunomiya; Tomonori Tamura; Itaru Hamachi
• 通讯作者: Itaru Hamachi