オルガネラ膜接触部位の可視化蛍光プローブの創製および応用

用于细胞器膜接触位点可视化的荧光探针的创建和应用

基本信息

批准号：
22KJ1611
负责人：
田中良來
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では，近赤外蛍光特性をもつホスファローダミン色素(POR)について，その多機能化とオルガネラ膜接触部位可視化プローブへの展開に取り組んでいる．今年度は，極性応答PORの構造物性相関と細胞イメージングへの応用に取り組んだ．まず，末端アミノ基上のアルキル基の数を変換し，種々の誘導体を合成した．得られた色素群はいずれも中性緩衝液中で強い吸収・蛍光を示し，溶媒の極性環境に応答して分子内スピロ環化平衡に由来する蛍光のスイッチングが可能であった．また，アミノ基上のアルキル基が減少するに従い，吸収・蛍光波長が短波長シフトすること，スピロ環化平衡が閉環側へシフトすることを見出した．各色素に対し，ハロタグタンパク質に対するリガンドを連結することで，細胞内オルガネライメージングに適用可能とした．吸収・蛍光が短波長シフトした色素については，近赤外領域にてSTED顕微鏡を用いた超解像イメージングに応用させることにも成功した．さらに，これらの蛍光性リガンドはハロタグタンパク質に対する特異性が高く，発現量の低い細胞種でも効率的にオルガネラを標識できることが明らかになった．続いて，9位のアリール基の修飾を行なった．求核性置換基をカルボキシ基からスルホンアミド基に変換することで，スピロ環化平衡が大きく閉環側へシフトした．これに由来し，その蛍光性リガンドは細胞膜透過性の著しい向上が見られた．これにより低濃度条件での染色が可能となり，さらに近赤外領域の励起光を用いることで生理的環境でのイメージングに成功した．長時間イメージングの結果，細胞分裂中の細胞核の動態を追跡することにも成功した．以上の結果から，PORにおけるオルガネライメージングへの適用性だけでなく，波長や膜透過性といった，蛍光プローブとしての重要な特性を制御できることが明らかとなった．

在这项研究中，我们致力于制造具有近红外荧光特性的多功能磷罗丹明染料（POR），并将其开发成用于可视化细胞器膜接触位点的探针。今年，我们研究了极性响应POR的结构-性质关系及其在细胞成像中的应用。首先，通过改变末端氨基上的烷基数量来合成各种衍生物。所有获得的染料在中性缓冲液中均表现出强吸收和荧光，并且可以响应溶剂的极性环境而切换源自分子内螺环化平衡的荧光。我们还发现，随着氨基上烷基数量的减少，吸收和荧光波长向更短的波长移动，螺环化平衡向闭环方向移动。通过将每种染料与晕环标签蛋白的配体连接，我们可以将其应用于细胞内细胞器成像。我们还成功地将吸收和荧光已转移到较短波长的染料应用于近红外区域使用 STED 显微镜的超分辨率成像。此外，研究表明这些荧光配体对晕环标签蛋白具有高度特异性，即使在低表达水平的细胞类型中也可以有效地标记细胞器。接下来，对9位的芳基进行修饰。通过将亲核取代基从羧基转化为磺酰胺基，螺环化平衡显着向闭环方向移动。因此，荧光配体显示出细胞膜通透性的显着改善。这使得能够在低浓度条件下进行染色，并且通过使用近红外区域的激发光，我们成功地在生理环境中进行成像。通过长期成像，我们还能够追踪细胞分裂过程中细胞核的动态。从以上结果可以看出，该方法不仅适用于 POR 中的细胞器成像，而且还可以控制荧光探针的重要特性，例如波长和膜渗透性。