Structural analysis of V-ATPase by cryo-EM

通过冷冻电镜对 V-ATP 酶进行结构分析

基本信息

批准号：
22KJ2042
负责人：
中西温子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2042/
关键词：
Cryo-electron microscopy 低温電子顕微鏡 V-ATPase 構造解析 Cryo-electron tomography

项目摘要

V-ATPase (液胞型 ATPase、以下 VoV1 と記す) は、細胞のほとんどの空胞系膜のほか、破骨細胞やがん細胞の細胞膜にも存在し、ATP の加水分解エネルギーを使いプロトンを輸送することで、細胞内外の酸性環境を制御している。VoV1 が形成する酸性環境は、細胞において多くの重要な役割を果たしている一方、VoV1 の機能・構造に関する十分な知見は得られていない。令和3年度の研究では、研究初年度に引き続き、構造解析を行うための哺乳類細胞由来 VoV1 の精製系確立を中心に研究を遂行し、ラット脳組織およびがん細胞から VoV1 を精製することに成功した。精製試料を負染色法にて観察したところ、安定的に精製された VoV1 複合体を確認することができた。次いで、低温電子顕微鏡 (Cryo-EM) による単粒子解析を行うための凍結試料を作製し、Cryo-EM 観察した結果、VoV1 と思われる密度を確認した。一方、細胞内で機能している VoV1 の構造を解析するため、VoV1 が局在する細胞内オルガネラであるシナプス小胞を対象として、トモグラフィー解析を試みた。Cryo-EM を用いて、氷包埋したシナプス小胞の傾斜画像シリーズを取得し、3次元像を再構成した結果、より高分解能の構造解析に適した再構成像を得ることができなかった。解析結果から、傾斜画像間の位置合わせを高精度で行う必要性が示唆されたことから、試料作製方法を最適化する必要があることが明らかとなった。また、より高分解能で構造解析を行うための Cryo-EM 画像の収集方法についても現在検討を行なっている。

V-ATP酶（液泡ATP酶，以下简称VoV1）存在于大多数细胞的液泡膜以及破骨细胞和癌细胞的细胞膜中，并利用ATP水解的能量来运输质子，它控制细胞内外的酸性环境。尽管VoV1形成的酸性环境在细胞中发挥着许多重要作用，但关于VoV1的功能和结构尚未获得足够的了解。延续第一年的研究，2021财年的研究重点是建立哺乳动物细胞来源的VoV1的纯化系统进行结构分析，并将从大鼠脑组织和癌细胞中纯化VoV1取得成功。当使用负染色观察纯化的样品时，确认了稳定纯化的VoV1复合物。接下来，使用冷冻电子显微镜(Cryo-EM)制备冷冻样品用于单颗粒分析，并且作为Cryo-EM观察的结果，确认了被认为是VoV1的密度。另一方面，为了分析 VoV1 在细胞内发挥功能的结构，我们尝试对突触小泡进行断层扫描分析，突触小泡是 VoV1 定位的细胞内细胞器。使用冷冻电镜获得一系列冰包埋突触囊泡的倾斜图像并重建 3D 图像，我们无法获得适合更高分辨率结构分析的重建图像。分析结果表明需要高精度对齐倾斜图像，这清楚地表明需要优化样品制备方法。我们目前还在研究收集冷冻电镜图像以进行更高分辨率的结构分析的方法。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

好熱菌FoF1の動的解析によって回転機構を明らかにする

嗜热细菌 FoF1 的动态分析揭示旋转机制

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
中野敦樹;中西温子;岸川淳一;横山謙
通讯作者：
横山謙

クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によるATPγS存在下V/A-ATPaseの中間体構造

使用冷冻电子显微镜进行单颗粒分析确定 ATPγS 存在下 V/A-ATP 酶的中间结构

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
佐伯詩織;岸川淳一;中西温子;中野敦樹;横山謙
通讯作者：
横山謙

Mechanical inhibition of isolated Vo from V/A-ATPase for proton conductance

从 V/A-ATP 酶中分离出来的 Vo 对质子传导的机械抑制

DOI：
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
0
作者：
岸川淳一;中西温子;古田綾;加藤貴之;難波啓一;玉腰雅忠;光岡薫;横山謙
通讯作者：
横山謙

Mechanical inhibition of isolated Vo from V/A-ATPase for proton conductance

从 V/A-ATP 酶中分离出来的 Vo 对质子传导的机械抑制

DOI：
10.7554/elife.56862
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
7.7
作者：
Kishikawa Jun;Nakanishi Atsuko;Furuta Aya;Kato Takayuki;Namba Keiichi;Tamakoshi Masatada;Mitsuoka Kaoru;Yokoyama Ken
通讯作者：
Yokoyama Ken

クライオ電子線トモグラフィー法からの糸状仮足中のアクチン繊維とファシンのサブトモグラム平均化

冷冻电子断层扫描丝状伪足中肌动蛋白纤维和肌成束蛋白的亚断层图平均