解糖系とリン脂質合成系の結合による細胞分裂の試験管内再構成

通过结合糖酵解和磷脂合成系统体外重建细胞分裂

基本信息

批准号：
22KJ2689
负责人：
佐藤岳
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2689/
关键词：
合成生物学

项目摘要

ゲノム科学により、細胞に最低限必要な機能は解糖系、タンパク質合成系、細胞分裂系、ゲノム複製系であることが明らかになった。これらの生化学システムは、全て試験管内において再構成が達成されているため、これらを組み合わせることで生命そのものの再構成に迫ることができる。私は採用以前に、解糖系とタンパク質合成系の共役系を試験管内において再構成することに成功していた (G-PURE)。G-PUREは、解糖系が生産したエネルギーを使ってタンパク質を合成する。本研究課題では、G-PUREにリン脂質合成系を導入することによって、従来のリン脂質合成系の活性を向上し、細胞分裂を試験管内において再現することを目指している。今年度は、G-PUREの2つの問題を解決した。1つ目は、G-PUREの老廃物の蓄積に伴うpHの低下である。pH低下が合成タンパク質を阻害することが示唆されたため、老廃物を乳酸からエタノールへと変更した。変更にあたって、新たに2種類の酵素を精製し、最適濃度を検討した。これによってpHの低下を回避し、G-PUREのタンパク質合成量を約2倍に向上することができた。2つ目は、G-PUREのエネルギー源がグルコースではなくグルコース6リン酸 (G6P)である点である。多くの生命はグルコースを取り込んで代謝することでエネルギーや重要な生体分子を合成しているため、グルコースの取り込み機構は多く存在する。しかしG6Pの取り込み機構は存在しないため、G6Pをエネルギー源とするG-PUREは、外界から栄養を得ることができず、活動時間に限界があった。そこで、グルコースからG6Pを合成する酵素を導入することで、グルコースをエネルギー源とするG-PUREを構築した。グルコースを基質とすることで一時的にタンパク質合成量が低下したが、低分子組成を検討することでG6P使用時と同程度の活性を維持することができた。

基因组科学表明，细胞所需的最低功能是糖酵解、蛋白质合成、细胞分裂和基因组复制。所有这些生化系统都已在体外重建，因此通过将它们结合起来，我们可以重建生命本身。在被录用之前，我已经成功重建了体外糖酵解和蛋白质合成的耦合系统（G-PURE）。 G-PURE 利用糖酵解产生的能量来合成蛋白质。在本研究项目中，我们的目标是通过将磷脂合成系统引入G-PURE来提高传统磷脂合成系统的活性并在体外再现细胞分裂。今年，我们用 G-PURE 解决了两个问题。首先是由于 G-PURE 废物的积累而导致 pH 值下降。废物从乳酸变为乙醇，因为 pH 值下降会抑制蛋白质合成。在进行这一改变时，我们纯化了两种新型酶并检查了它们的最佳浓度。结果，我们能够避免 pH 值下降，并将 G-PURE 中的蛋白质合成量增加约两倍。其次，G-PURE的能量来源是葡萄糖6-磷酸（G6P）而不是葡萄糖。许多生物体通过摄取和代谢葡萄糖来合成能量和重要的生物分子，因此葡萄糖的摄取机制有多种。但由于没有G6P摄取机制，以G6P为能源的G-PURE无法从外界获取营养，活性时间也有限。因此，通过引入一种从葡萄糖合成G6P的酶，我们构建了使用葡萄糖作为能源的G-PURE。虽然通过使用葡萄糖作为底物，蛋白质合成量暂时减少，但通过检查低分子组成，可以维持与使用G6P时相同的活性水平。