in situハイブリダイゼーション法を利用したカンキツ不定胚形成過程の解析

原位杂交法分析柑橘体细胞胚形成过程

基本信息

批准号：
08760033
负责人：
馬場正
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760033/
关键词：
組織形態学包理法蛍光色素テクノビット

项目摘要

本研究では、in situハイブリダイゼーション法の植物材料への適用を念頭におき、そのプロトコールの確立を中心に行った。計画の最終目標であったin situのPCRのプロトコールの確立には成功しなかったが、手順中の重要なステップである新しい包理法による切片作製および蛍光色素による染色に成功し、また、PCRの最適条件の検討も行った。得られた結果の概要は以下の通りである。1.組織形態学的手法として、テクノビット樹脂を用いた包理法を確立した。従来用いられてきたパラフィン包理法によって作製したプレパラートと比較して、組織・細胞の保存性に著しく優れていた。また、毒性のある薬品の使用が少なかったうえ、迅速な切片作製が可能であった点、現在最も一般的な樹脂であるスパー樹脂による包理法よりも利用価値が高いものと思われた。2.テクノビットによって作製した切片の染色性を確認するため、DAPIおよびCalcofluor Whiteで染色を行った。その結果両蛍光色素とも十分に利用できることを確認した。3.分子生物学的手法としてDNA増幅装置(PCR)の最適反応条件の検討を行った。PCRの利用経験はわずかであったので、既存のデータのあるカランボラの葉を材料に手法の確認を行った。DNAの抽出法としていくつかの方法を試みたが、その中で、PEGを用いて多糖類を除去した後、SDSとCTABを併用する方法がもっとも効率的に全DNAを抽出できた。RAPD法によってカランボラ12系統の識別が可能かどうかを検討した結果、確実な系統間識別が可能であることがわかり、PCRの反応溶液組成および設定条件の妥当性が確認された。

在这项研究中，我们专注于建立原位杂交方案，并考虑到该方法在植物材料上的应用。尽管我们未能成功建立原位 PCR 方案（这是该计划的最终目标），但我们成功地使用新的包埋方法和荧光染料染色来制备切片，这是该过程中的重要步骤，而且我们也成功了在开发原位 PCR 方案时，我们还研究了最佳条件。所得结果总结如下。 1.我们建立了一种使用Technovit树脂作为组织形态学方法的包埋方法。与传统石蜡包埋法制备的制剂相比，组织和细胞的保存明显优越。此外，它被认为比使用目前最常见的树脂 Spar 树脂的包埋方法更有用，因为它需要较少的有毒化学品，并且可以快速制备切片。 2. 为了确认用 Technovit 制备的切片的染色性，用 DAPI 和 Calcoflor White 进行染色。结果证实，两种荧光染料都可以得到充分利用。 3.我们研究了作为分子生物学方法的DNA扩增设备（PCR）的最佳反应条件。由于我对 PCR 的使用经验很少，因此我使用已有数据的杨桃叶测试了该方法。人们尝试了多种提取DNA的方法，但其中最有效的方法是使用PEG去除多糖，然后结合使用SDS和CTAB来提取总DNA。通过RAPD法对能否区分12种杨桃菌株进行了调查，结果发现可以可靠地区分菌株，并且确认了PCR反应液组成和设定条件的有效性。