Development of new therapy for urinary incontinence by mitophagy activation of urethral rhabdosphincter

通过尿道横纹括约肌线粒体自噬激活治疗尿失禁的新疗法

基本信息

批准号：
22K09532
负责人：
三股浩光
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

外尿道括約筋は膜様部尿道を取り囲む横紋筋で、尿禁制に寄与しているが、加齢とともに脆弱化し、尿失禁の一因となる。本研究では、まず透過型電子顕微鏡によるヒト外尿道括約筋の異常ミトコンドリアの蓄積を検討し、異常ミトコンドリアの除去機構であるマイトファジーについて検討を行った。インフォームド・コンセントの得られた膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織と腹直筋組織を採取し、電子顕微鏡標本作成及び分子学実験用に処理を行った。組織学的実験は両組織を2％グルタールアルデヒド固定液で保存し電子顕微鏡ブロックを作成した。また分子生物学的実験用に、採取した組織をディープ・フリーザーにて保存した。組織学的実験はこれまでに7例の電子顕微鏡標本を作製した。2例については外尿道括約筋組織と腹直筋組織の透過型電子顕微鏡写真が得られており、外尿道括約筋組織は腹直筋組織と比べて、筋束に隙間が多く、ミトコンドリア数の減少や空洞化・膨化を認め異常ミトコンドリアの蓄積が示唆された。また筋線維別に外尿道括約筋におけるミトコンドリア異常についても観察された。また細胞学実験では膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織外尿道括約筋の微量組織を細切し、コラゲナーゼ処理後に初代培養を行った。分離培養した外尿道括約筋幹細胞にCSII-CMV-CDK4R24C、CSII-CMV-cyclin D1 及びCSII-CMV-TERTを遺伝子導入した。さらに横紋筋幹細胞マーカーであるCD56（NCAM）に対する蛍光抗体を用いてフローサイトメーターによって横紋筋幹細胞を分離し長寿化細胞株を樹立した。これまでに8例の外尿道括約筋組織の初代培養を行っており、4例に長寿化遺伝子を導入して3例の長寿化細胞株を樹立した。これらの細胞株について分化・増殖実験を行い横紋筋に分化することを確認した。

尿道外括约肌是包围尿道膜的横纹肌，有助于尿失禁，但它会随着年龄的增长而减弱，成为尿失禁的一个促成因素。在本研究中，我们首先使用透射电子显微镜检查了人类尿道外括约肌中异常线粒体的积累，并研究了线粒体自噬（一种清除异常线粒体的机制）。在获得知情同意的全膀胱切除术患者手术期间收集尿道外括约肌组织和腹直肌组织，并进行电子显微镜和分子实验处理。对于组织学实验，两种组织均保存在 2% 戊二醛固定液中，并制备电子显微镜块。此外，收集的组织储存在深冰箱中用于分子生物学实验。对于组织学实验，迄今为止已制备了七个电子显微镜标本。 2例均获得尿道外括约肌组织和腹直肌组织的透射电镜照片，尿道外括约肌组织的肌束间隙较腹直肌组织多，线粒体数量减少，空洞增多。观察到由于肿胀和肿胀而异常线粒体的积累。还观察到每条肌纤维的尿道外括约肌线粒体异常。另外，在细胞学实验中，手术时从膀胱全切除病例中切取少量尿道外括约肌组织，用胶原酶处理后进行原代培养。将CSII-CMV-CDK4R24C、CSII-CMV-cyclin D1和CSII-CMV-TERT引入分离培养的尿道外括约肌干细胞中。此外，使用流式细胞仪使用横纹肌干细胞标记物CD56荧光抗体（NCAM）分离横纹肌干细胞，并建立了长寿命细胞系。迄今为止，我们已对8例尿道外括约肌组织进行了原代培养，并通过向4例中导入长寿基因建立了3个长寿细胞系。我们对这些细胞系进行了分化和增殖实验，并证实它们分化为横纹肌。