Detection of circulating tumor cells with a novel microfluidic system in patients with lung cancer

使用新型微流体系统检测肺癌患者的循环肿瘤细胞

基本信息

批准号：
22K08987
负责人：
田中文啓
金额：
$ 2.58万
依托单位：
University of Occupational and Environmental Health, Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

循環腫瘍細胞は原発巣から遊離した癌細胞が血管内へ浸潤し、血流に乗って遠隔転移を形成する原因そのものである。この循環腫瘍細胞の検出および分子生物学的特徴の解析は、癌の遠隔転移検出とその制御につながるため非常に重要である。これまでに我々は、高感度CTC検出系の開発に取り組み、マクロ流路システム(CTCchip)を完成させた。この新開発CTC-chipは、CellSearchを超える高感度CTC検出システムであり、更に捕捉したCTCの分子生物学的解析が可能であることを特徴としている。このシステムを使用し、肺癌や悪性胸膜中皮腫において高効率にCTCを検出することが可能となり、捕捉したCTCがPCRベースで遺伝子変異の検出が可能であることを確認している。我々は今回、このシステムを更に先に一歩進めるため、捕捉されたCTCを次世代シーケンサーを使用し、網羅的に変異解析が可能かどうかを検討した。本研究では、血液サンプルを使用し、血中に含まれるCTCを捕捉・変異解析可能な系を樹立するため、まずは細胞株を使用した基礎検討を行った。肺癌細胞株(PC9, H1975, H441)を使用し、CTC-chip上に捕捉された細胞を鏡視下にてマイクロマニュピレーターで単離した。その単離した細胞からDNAを抽出して、次世代シーケンサー(Ion PGM)にてtarget sequenceを試みた。本検討において、我々はCTC chip上での細胞の固定法を工夫した。如何にDNAにダメージを入れず、生細胞に近い状態で細胞が回収できるかを工夫することで、高精度にtarget sequenceできる方法を構築した。この方法により、検討に使用した肺癌細胞株(PC9, H1975, H441)の全てでsingle cellから50個の癌関連遺伝子を網羅的に変異解析することが可能であることを確認した。

循环肿瘤细胞是原发肿瘤释放的癌细胞浸润到血管并通过血流形成远处转移的原因。循环肿瘤细胞的检测及其分子生物学特性的分析非常重要，因为它们可以检测和控制癌症的远处转移。到目前为止，我们一直致力于高灵敏度CTC检测系统的开发，并已完成了宏通道系统（CTCchip）。这款新开发的CTC芯片是比CellSearch灵敏度更高的CTC检测系统，其特点还在于能够对捕获的CTC进行分子生物学分析。使用该系统，可以高效地检测肺癌和恶性胸膜间皮瘤中的CTC，并且我们已经证实捕获的CTC可以用于使用基于PCR的方法检测基因突变。为了使该系统更进一步，我们研究了是否可以使用下一代测序仪对捕获的 CTC 进行全面的突变分析。在本研究中，我们首先使用细胞系进行基础研究，以建立一个可以使用血液样本捕获和突变分析血液中所含 CTC 的系统。使用肺癌细胞系（PC9、H1975、H441），在显微镜下使用显微操作器分离 CTC 芯片上捕获的细胞。从分离的细胞中提取 DNA，并尝试使用下一代测序仪 (Ion PGM) 进行目标测序。在这项研究中，我们设计了一种将细胞固定在 CTC 芯片上的方法。通过设计在不损坏 DNA 的情况下恢复接近活细胞状态的细胞的方法，我们开发了一种可以进行高度准确的目标测序的方法。通过这种方法，我们证实可以全面分析研究中使用的所有肺癌细胞系（PC9、H1975、H441）中单个细胞的 50 个癌症相关基因的突变。