大黄の修治による血流改善メカニズムの解明および漢方処方への応用

阐明大黄治疗改善血流的机制及其在中草药方剂中的应用

• 批准号: 22K07425
• 负责人: 太田 美里
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07425/
• 关键词: 大黄; 内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）; 一酸化窒素（NO）; 血流改善; 修治; 瀉下

本研究では、大黄の修治による血流改善作用の向上を検証することを目的として、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を使ったin vitroでの血流改善作用の評価系を構築するための以下の実験を行った。（１）再現性のある実験方法の検証：HUVECは細胞増殖速度や薬物に対する反応性に個体差があるのと同時に継代を続けることで再現性がとれないという問題があった。そこで、HUVECの株化細胞のHUEhT-1を使ったが、HUVECに比して増殖が遅く、大黄エキスに対する反応性も低かった。そのため、HUVECの同じ継代数のストックを大量に作成したところ、毎回、同じ条件で実験できるようになった。（２）内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）発現量の評価系の構築：Western blot法では様々な修治品のサンプルを同時に評価できないため、96 well plateを用いたin cell-ELISA法およびWestern blot法を簡略化したドットブロットによる評価系を構築し、大黄添加で濃度依存的にeNOSの発現量が増加することを確認した。（３）一酸化窒素（NO）産生量の評価系の構築：Griess法によるeNOS由来のNO産生量の検出感度を上げた評価系を構築し、大黄添加により濃度依存的にNO産生量が増加することを確認した。実験系構築に時間を要したため、R4年度は修治品の検証にまでは至らなかったが、以上の実験系を用いた修治大黄の血流改善作用の評価、およびその活性本体の解明により、伝統医学的な瀉下から血流改善への作用変化の科学的エビデンスを得ることが可能となる。更には婦人科の漢方処方に適した血流改善作用が高い大黄の開発を目指す。

在本研究中，为了验证大黄治疗对血流改善效果的改善，我们进行了以下步骤，利用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）构建血流改善效果的体外评价体系进行了实验。实施。 （1）可重复性实验方法验证：HUVEC在细胞生长速度、药物反应活性等方面存在个体差异，同时存在因连续传代而无法实现重复性的问题。因此，使用HUVEC细胞系HUEhT-1，但其增殖速度比HUVEC慢，并且其对大黄提取物的反应性也较低。因此，通过创建大量具有相同传代数的HUVEC库存，我们能够每次在相同的条件下进行实验。 (2)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达水平评价体系的构建：由于Western blot法无法同时评价多种修复产物的样品，因此采用96孔板的in cell-ELISA法和We使用斑点印迹（印迹法的简化版本）构建了评估系统，并证实大黄的添加以浓度依赖性方式增加了 eNOS 的表达水平。 (3)一氧化氮(NO)生成评价体系的构建：构建了利用格里斯法对eNOS衍生的NO生成检测灵敏度提高的评价体系，大黄的添加以浓度依赖性方式增加了NO生成经证实。由于实验系统的构建需要时间，我们无法在R4年验证修复产品，但通过使用上述实验系统评估蜀鸡大黄的血流改善效果并阐明其活性物质，我们能够将有可能获得从医疗宣泄到改善血流的效果变化的科学证据。此外，我们的目标是开发具有高血流改善作用、适合妇科中草药处方的大黄。