組織特異的ノックアウト手法を用いた骨格筋ジャンクトフィリンのサブタイプ別機能解析

使用组织特异性敲除法按亚型对骨骼肌嗜肉素进行功能分析

基本信息

批准号：
22K06828
负责人：
中田勉
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

骨格筋の興奮収縮連関は、細胞膜上のL型Ca2+チャネルと、筋小胞体膜上のリアノジン受容体が協調することで引き起こされる。L型Ca2+チャネルとリアノジン受容体が共局在することは，電気信号をカルシウム信号に変換するために必須であり、その異常は致死的である。これらの分子が近接する「場」を結合膜と呼び、ジャンクトフィリン（JP）はこの構造を維持する分子である。成熟した骨格筋にはJP1およびJP2の二つのサブタイプが発現しているが、これらの機能的差異の詳細は明らかになっていない。そこで、骨格筋の興奮収縮連関におけるJP1とJP2の生理学的役割を、サブタイプ別に明らかにすることを目的に研究を行った。解析にはCASAAV法を用いることとした。本法では、Cre依存的にCas9-GFPを発現するトランスジェニックマウス（Flox-Cas9-GFPマウス）に、Cre配列と目的遺伝子に対するgRNAを発現するアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）を投与する。この方法により、特定組織の遺伝子のみを欠損させうることが報告されている。そこで、AAVにJP1、JP2の遺伝子を標的としたgRNAを組み込み、これを成獣Flox-Cas9-GFPマウスの前脛骨筋および短趾屈筋に注射した。しかし、感染4週間後に前脛骨筋の収縮力を測定したところ、有意な変化は認められなかった。さらにJP1、JP2のウェスタンブロッティングを行ったところ、十分な発現量の減少が認められなかった。このことから、本条件では解析が困難であることが明らかとなった。現在、より高い遺伝子欠損効率を達成するため、AAVの投与量およびgRNA配列の最適化を行っている。

骨骼肌中的兴奋-收缩耦合是由细胞膜上的L型Ca2+通道与肌浆网膜上的兰尼碱受体之间的合作引起的。 L 型 Ca2+ 通道和兰尼碱受体的共定位对于将电信号转化为钙信号至关重要，异常是致命的。这些分子聚集在一起的区域称为结合膜，而 junktophilin (JP) 就是维持这种结构的分子。 JP1和JP2这两种亚型在成熟骨骼肌中表达，但其功能差异的细节尚不清楚。因此，我们进行了一项研究，以按亚型阐明 JP1 和 JP2 在骨骼肌兴奋-收缩关系中的生理作用。我们决定使用CASAAV方法进行分析。在此方法中，将表达目的基因的 Cre 序列和 gRNA 的腺相关病毒载体 (AAV) 施用给以 Cre 依赖性方式表达 Cas9-GFP 的转基因小鼠（Flox-Cas9-GFP 小鼠）。据报道，这种方法只能删除特定组织中的基因。因此，我们将靶向JP1和JP2基因的gRNA整合到AAV中，并将其注射到成年Flox-Cas9-GFP小鼠的胫骨前肌和指短屈肌中。然而，在感染后4周测量胫骨前肌的收缩力时，没有观察到明显的变化。此外，当进行JP1和JP2的Western印迹时，没有观察到表达水平的充分降低。由此可见，在这种条件下进行分析是很困难的。我们目前正在优化AAV剂量和gRNA序列，以实现更高的基因删除效率。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

A reconstituted depolarization-induced Ca2+ release platform for validation of skeletal muscle disease mutations and drug discovery

重建的去极化诱导 Ca2+ 释放平台，用于验证骨骼肌疾病突变和药物发现

DOI：
10.1085/jgp.202213230
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
3.8
作者：
Murayama Takashi;Kurebayashi Nagomi;Numaga;Kobayashi Takuya;Okazaki Satoru;Yamashiro Kyosuke;Nakada Tsutomu;Mori Shuichi;Ishida Ryosuke;Kagechika Hiroyuki;Yamada Mitsuhiko;Sakurai Takashi
通讯作者：
Sakurai Takashi