ミトコンドリアCa2+動態を起点とした神経細胞機能制御の分子機序解明

基于线粒体Ca2+动力学阐明神经元功能控制的分子机制

基本信息

批准号：
22K06841
负责人：
竹内綾子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
University of Fukui
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06841/
关键词：
ミトコンドリアカルシウムトランスポータ

项目摘要

抗体磁気ビーズを用いて、純度の高いミトコンドリア単離法を確立した。新たな単離法で得た脳および心筋ミトコンドリアサンプルには、従来の単離法で問題となっていた細胞膜の混入が極めて少ないことを、Western blotにより細胞膜マーカーNa+/K+ ATPase alpha1 subunitを評価することで確認した。マルチモードプレートリーダーEnSpireを用いた蛍光測定により、純度の高い単離ミトコンドリアCa2+動態の生物物理学的特性を解析した。単離ミトコンドリアにCa2感受性蛍光色素Fluo-8, AMを負荷し、ミトコンドリア内へのCa2+流入特性を評価したところ、心筋と異なり脳ではミトコンドリア膜電位脱分極時においてもCa2+流入システムが存在すること、このシステムがNa+ならびにK+感受性であることを発見した。また、心筋と脳ミトコンドリア膜タンパク質群の網羅的解析を行い、サブトラクションすることによって、それぞれの臓器に特異的に発現する膜タンパク質の候補を複数得た。Osterらによる簡易神経細胞数理モデル（Frontiers in Computational Neuroscience, 2015）を竹内の数理モデルプラットフォーム上で再構築し、膜興奮・Ca2+変動を計算するとともに、ミトコンドリア機能の実装に取り組んだ。今後、脳のミトコンドリアに特徴的なCa2+輸送特性が、神経細胞においてどのような挙動を示すのか、その生理的意義について評価していく。

我们建立了使用抗体磁珠的高纯度线粒体分离方法。使用蛋白质印迹评估细胞膜标记物 Na+/K+ ATPase α1 亚基，证明使用新分离方法获得的大脑和心脏线粒体样品含有极少的细胞膜污染，这是传统分离方法存在的问题。使用多模式酶标仪 EnSpire 通过荧光测量来分析分离的线粒体 Ca2+ 动力学的生物物理特性。当分离的线粒体负载Ca2+敏感荧光染料Fluo-8、AM，并评估Ca2+流入线粒体的特征时，发现与心肌不同，即使线粒体膜电位降低，大脑中也存在Ca2+流入系统我们发现该系统对 Na+ 和 K+ 敏感。此外，通过对心肌和脑线粒体膜蛋白组进行综合分析和扣除，我们获得了在每个器官中特异性表达的多个候选膜蛋白。我们在Takeuchi的数学模型平台上重建了Oster等人的简化神经元数学模型（Frontiers in Computational Neuroscience，2015），计算了膜兴奋性和Ca2+波动，并致力于实现线粒体功能。未来我们将评估脑线粒体Ca2+转运特性在神经元中的表现及其生理意义。