Analysis of lipid domains around receptor tyrosine kinases by super-resolution microscopy

通过超分辨率显微镜分析受体酪氨酸激酶周围的脂质结构域

基本信息

批准号：
22K06609
负责人：
阿部充宏
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

過去の生化学的な解析から、受容体型チロシンキナーゼは、脂質ラフトに局在することが示唆されていた。本研究では、「脂質プローブ」と「超解像顕微鏡法」とを組み合わせることにより、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフトに局在するか、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフト中の脂質によって活性制御されるか、を明らかにすることを目的とする。本年度は、代表的な受容体型チロシンキナーゼであるEGFRが、どの脂質ドメインに存在するかを調べるために、EGFRと脂質プローブとの共局在解析を超解像顕微鏡によって行った。脂質プローブとして、SMに対してはEquinatoxin II、クラスター化したSMに対してはLysenin、SM/Chol複合体に対してはNakanori、Cholに対してはD4H、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 (PIP2) に対してはPLC delta-PH、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸 (PIP3) に対してはGRP1-PH、ホスファチジルセリン (PS) に対してはevectin2-PHを用いた。超解像顕微鏡の共局在率はRipley’s bivariate K-functionで評価した。その結果、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。ところが、EGF刺激後には共局在が低下することが分かった。一分子イメージング法でも検証した結果、同様の結果が得られた。この共局在の低下は、PLC gammaによって、EGFR周囲のPIP2が分解されるためであることが示唆された。また、EGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについて、ヒトのcDNAから50種類以上をクローニングし、次年度以降の超解像顕微鏡による解析のための準備を行った。

先前的生化分析表明受体酪氨酸激酶位于脂筏中。在这项研究中，通过结合“脂质探针”和“超分辨率显微镜”，我们证明受体酪氨酸激酶位于脂筏中，或者受体酪氨酸激酶的活性受到脂筏中脂质的调节。目的是澄清是否今年，为了研究典型受体酪氨酸激酶EGFR的脂质结构域存在于哪个脂质域中，我们使用超分辨率显微镜对EGFR和脂质探针进行了共定位分析。作为脂质探针，用于 SM 的马奎毒素 II、用于簇状 SM 的 Lysenin、用于 SM/Chol 复合物的 Nakanori、用于 Chol 的 D4H，以及用于 PLC delta-PH 的磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP2)、磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸（ PIP3) 用于 GRP1-PH、磷脂酰丝氨酸 (PS)为此，使用了 evetin2-PH。使用 Ripley 的双变量 K 函数评估超分辨率显微镜的共定位率。结果，在 EGF 刺激之前，观察到 EGFR 经常与 PIP2 共定位。然而，发现 EGF 刺激后共定位减少。在验证单分子成像方法时也得到了类似的结果。这种共定位的减少被认为是由于 PLC γ 降解了 EGFR 周围的 PIP2。此外，还从人类cDNA中克隆了除EGFR以外的50多种受体酪氨酸激酶，并为次年使用超分辨率显微镜进行分析做好了准备。