がん細胞の浸潤転移を制御するダイナミンクロスブリッジ機構の解析

控制癌细胞侵袭和转移的动力跨桥机制分析

• 批准号: 22K06580
• 负责人: 阿部 匡史
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06580/
• 关键词: ダイナミン; アクチン; がん; 微小管; 仮足; 浸潤; 走化

本研究は、がん細胞における仮足形成に必須であるアクチン及び微小管の再構成機構（ダイナミンクロスブリッジ）を明らかにする。本年度は、in vitro解析法を駆使してダイナミン２野生型、K562E、K562delta変異体によるアクチン線維束を電子顕微鏡にて観察し、クライオ電子顕微鏡による構造解析に向けた試料調製条件の最適化を試みた。ダイナミン２タンパクは、コムギ胚芽無細胞タンパク合成系を用いて調製した。アクチン線維束の観察は、負染色後、透過型電子顕微鏡を用いて行なった。ダイナミン２野生型により形成されたアクチン線維束は、１個あたり幅が約50nmで、K562E及びK562deltaにより形成されたアクチン線維束と同様であった。しかし、ダイナミン２野生型により形成されたアクチン線維束は、別の複数の線維束とともに、さらに束化していた。K562E及びK562delta変異体により形成されたアクチン線維束は、野生型のものと比べて顕著に再束化するアクチン線維が少なかった。そのため、ダイナミン２野生型を用いたアクチン線維束は、クライオ電子顕微鏡観察に不適であることが判明した。以降、K562EまたはK562delta変異体を用いたアクチン線維束を構造解析に使用することになった。また、クライオ電子顕微鏡観察する場合には、試料の濃度を高くする必要がある。しかしながら、ダイナミン２は、濃度の高い状態では、凝集しやすいため、条件のさらなる検討が必要になった。次年度には、分散したアクチン線維束の形成を高濃度に得る条件を探し出し、クライオ電子顕微鏡観察に備えたスクリーニングを行う予定である。

这项研究揭示了肌动蛋白和微管重排机制（动力跨桥），这对于癌细胞中伪足的形成至关重要。今年，我们将利用体外分析方法，使用电子显微镜观察 Dynamin 2 野生型、K562E 和 K562delta 突变体产生的肌动蛋白纤维束，并尝试优化使用冷冻电子显微镜 Ta 进行结构分析的样品制备条件。 Dynamin 2 蛋白是使用小麦胚芽无细胞蛋白合成系统制备的。负染色后使用透射电子显微镜观察肌动蛋白纤维束。 dynamin 2野生型形成的肌动蛋白纤维束宽度约为50 nm，与K562E和K562delta形成的肌动蛋白纤维束相似。然而，由dynamin 2野生型形成的肌动蛋白纤维束进一步与多个其他纤维束捆绑在一起。与野生型相比，K562E 和 K562delta 突变体形成的肌动蛋白纤维束重新捆绑的肌动蛋白纤维明显较少。因此，发现使用野生型dynamin 2的肌动蛋白纤维束不适合冷冻电子显微镜观察。从那时起，使用 K562E 或 K562delta 突变体的肌动蛋白纤维束已被用于结构分析。此外，当用冷冻电子显微镜观察时，需要增加样品的浓度。然而，dynamin 2 往往会在高浓度下聚集，因此需要进一步考虑条件。明年，我们计划寻找能够形成高浓度分散肌动蛋白纤维束的条件，并进行筛选，为冷冻电镜观察做准备。

项目成果

1.脂質膜結合活性が低下しているダイナミン２のCMT変異体は、ポドサイトにおけるアクチン線維の配向とアクチンバンドル形成を異常にする

1. 动力蛋白 2 的 CMT 突变体具有降低的脂膜结合活性，使足细胞中的肌动蛋白纤维方向和肌动蛋白束形成异常。

• 发表时间: 2022
• 作者: 山田浩司;阿部匡史;内橋貴之;成田哲博;竹田哲也;竹居孝二
• 通讯作者: 竹居孝二