Development of in vivo chemogenetics which allows cell specific regulation of GPCRs

体内化学遗传学的发展允许 GPCR 的细胞特异性调节

• 批准号: 22K05351
• 负责人: 堂浦 智裕
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05351/
• 关键词: ケモジェネティクス; Gタンパク質共役型受容体（GPCR）; 代謝型グルタミン酸受容体; リガンド; ノックインマウス; GPCR; 受容体; 化学遺伝学; 活性制御

交付申請書に記載した研究実施計画ではGタンパク質共役型受容体（GPCR）の一つである代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ5（mGlu5）の活性をin vivoで制御可能な方法論を化学遺伝学（ケモジェネティクス）に基づき構築することとしていた。しかしながら、mGlu5と配列相同性の高いmGlu1においてマウスを用いたin vivo実験が可能な状況に至ったため、2022年度はmGlu5ではなくmGlu1を標的分子としたin vivoにおいてGPCRの機能をサブタイプ選択的かつ細胞種選択的に解析可能な方法論の開発研究を実施した。これまでの研究から、研究代表者は野生型のmGlu1に結合して阻害する一方、T748W変異型のmGlu1に結合しても阻害しないリガンドとしてFPETを見出していた。しかしながら、FPETは野生型mGlu1に対する阻害能が少し低いことと水溶性が低いことから、マウスを用いたin vivo実験での使用に適したリガンドを再設計し、FPETと同様に野生型のmGlu1を阻害する一方でT748W変異型mGlu1を阻害しない性質を持ちつつ野生型mGlu1阻害能と水溶性が向上したリガンドとしてMPETを見出した。また、mGlu1のケモジェネティクスを進めるためにT748W変異型mGlu1ノックインマウスの作製と系統維持を実施した。T748W変異型mGlu1ノックインマウスはCRISPR/Cas9システムを利用した遺伝子編集により作製されたが、CRISPR/Cas9システムでは目的としない遺伝子にも損傷がある場合があるため、野生型マウスとの戻し交配（バッククロス）を実施し、T748W変異型mGlu1ヘテロノックインマウスを得た。さらに、これらを交配させてT748W変異型mGlu1ホモノックインマウスを得た。

拨款申请中描述的研究实施计划基于一种可以利用化学遗传学控制体内代谢型谷氨酸受体亚型 5 (mGlu5)（一种 G 蛋白偶联受体 (GPCR)）活性的方法（计划是根据化学遗传学构建。然而，由于mGlu1与mGlu5具有很高的序列同源性，因此可以使用小鼠进行体内实验，因此在2022年，我们的目标是使用mGlu1作为目标分子，在体内进行亚型选择性和亚型选择性测试GPCR功能我们进行了研究以开发一种允许细胞类型选择性分析的方法。在之前的研究中，主要研究人员发现 FPET 作为配体，可以结合并抑制野生型 mGlu1，但不会抑制 T748W 突变型 mGlu1。然而，由于FPET对野生型mGlu1的抑制能力稍低且水溶性较低，因此我们重新设计了适合在小鼠体内实验中使用的配体，并使用野生型mGlu1以及FPET作为我们发现的配体。抑制T748W突变体mGlu1但不抑制野生型mGlu1的配体，并且具有改善的水溶性和抑制野生型mGlu1的能力。此外，为了推进 mGlu1 化学遗传学，我们创建并维持了 T748W 突变型 mGlu1 敲入小鼠品系。 T748W突变型mGlu1敲入小鼠是通过使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑而创建的，但由于CRISPR/Cas9系统会损伤不感兴趣的基因，因此需要与野生型小鼠进行回交（backcrossing）。获得T748W突变mGlu1异基因敲入小鼠。此外，将它们杂交以获得T748W突变mGlu1同型敲入小鼠。

项目成果

代謝型グルタミン酸受容体のin vivo制御のためのケモジェネティックアプロー

代谢型谷氨酸受体体内调节的化学遗传学方法

• 发表时间: 2022
• 作者: 堂浦 智裕;長谷川 寛太;柏 俊太朗;松葉 佑弥;清中 茂樹
• 通讯作者: 清中 茂樹

In vivo 制御を指向した代謝型グルタミン酸受容体 mGlu1 変異体選択的なサイレントリガンドの開発

开发针对代谢型谷氨酸受体 mGlu1 突变体的沉默配体，用于体内调节

• 发表时间: 2023
• 作者: 堂浦 智裕;長谷川 寛太;柏 俊太朗;松葉 佑弥;清中 茂樹
• 通讯作者: 清中 茂樹

Coordination chemogenetics for activation of GPCR-type glutamate receptors in brain tissue

脑组织中 GPCR 型谷氨酸受体激活的协调化学遗传学

• DOI: 10.1038/s41467-022-30828-0
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 16.6
• 作者: Ojima Kento;Kakegawa Wataru;Yamasaki Tokiwa;Miura Yuta;Itoh Masayuki;Michibata Yukiko;Kubota Ryou;Doura Tomohiro;Miura Eriko;Nonaka Hiroshi;Mizuno Seiya;Takahashi Satoru;Yuzaki Michisuke;Hamachi Itaru;Kiyonaka Shigeki
• 通讯作者: Kiyonaka Shigeki