進化情報を構造シミュレーションに組み入れた合理的酵素設計とそのプロセス化

通过将进化信息纳入结构模拟来合理设计和加工酶

基本信息

批准号：
22K04841
负责人：
二井手哲平
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、設計した酵素の代謝工学応用を目指し、ドライ実験(設計)とウェット実験(検証)を双方向的に実施することで汎用的かつ堅牢な酵素設計プロセスを目指すことを目標としている。なかでも、酵素の基質・補酵素特異性を司るアミノ酸残基の同定から変換までのプロセス開発と、酵素の耐熱化を指向したアミノ酸残基の選択からin silicoスクリーニングまでの耐熱化酵素のプロセス開発の2つに取り組んでいる。プロジェクト1年目はリンゴ酸酵素をモデル酵素として補酵素特異性に関わるアミノ酸残基の同定と特異性変換に取り組んだ。補酵素特異性決定残基の同定は、データベースから取得したアミノ酸配列を入力とした機械学習により実施した。その結果、作成した機械学習モデルは99.3%の精度でNADP依存型とNAD依存型のリンゴ酸酵素を分類することができ、さらにそのモデルの偏回帰係数を解析することでどの位置のアミノ酸残基が補酵素特異性に寄与しているかを推定することができた。次にこの結果を元に、未だ立体構造が明らかではない大腸菌由来NADP+依存型リンゴ酵素の補酵素特異性改変に取り組んだ。その結果、実用的なスクリーニング工程なしに、補酵素特異性をNAD+依存性に完全に転換することが示された。基質特異性を司るアミノ酸残基は基質ポケットの内部だけでなく、周囲の残基も補酵素特異性に大きく寄与することを示した。これらの残基は、結晶構造観察から同定することが困難であり、構造的に相同で機能的に異なる酵素のアミノ酸配列を入力データとして、高精度で推論可能な機械学習モデルを作ることができた。

在本研究中，我们的目标是将设计的酶应用到代谢工程中，并通过交互进行干实验（设计）和湿实验（验证）来创建通用且稳健的酶设计过程。特别是，我们正在开发从控制酶的底物/辅酶特异性的氨基酸残基的识别到转化的工艺，以及提高热稳定性的酶的工艺开发，从氨基酸残基的选择到计算机筛选以使酶更加热稳定。我们正在做两件事。在该项目的第一年，我们致力于使用苹果酸酶作为模型酶来鉴定与辅酶特异性和转化特异性相关的氨基酸残基。使用从数据库获得的氨基酸序列作为输入，通过机器学习进行辅酶特异性决定残基的鉴定。结果，所创建的机器学习模型能够以 99.3% 的准确率对 NADP 依赖性和 NAD 依赖性苹果酸酶进行分类，并且通过分析模型的偏回归系数，可以对氨基酸残基位于哪些位置进行分类。可以估计这是否有助于辅酶特异性。接下来，基于这一结果，我们致力于修改源自大肠杆菌的 NADP+ 依赖性苹果酶的辅酶特异性，其 3D 结构仍不清楚。结果表明，辅酶特异性完全转变为 NAD+ 依赖性，无需任何实际的筛选步骤。结果表明，控制底物特异性的氨基酸残基不仅位于底物袋内部，而且周围的残基也对辅酶特异性有显着贡献。这些残基很难通过晶体结构观察来识别，并且可以使用结构同源但功能不同的酶的氨基酸序列作为输入数据来创建可以高精度推断的机器学习模型。