清酒酵母のウラシル要求性株を用いたイオンビーム育種技術の遺伝子変異点の特性解析

使用清酒酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株进行离子束育种技术中基因突变点的表征

• 批准号: 21K12528
• 负责人: 渡部 貴志
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Gunma Prefectural Industrial Technology Center
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K12528/
• 关键词: 清酒酵母; イオンビーム; ウラシル要求性; 生菌率

きょうかい清酒酵母701号（K701）を用いて、従来の炭素イオンビームの他に、ヘリウム、ネオン、アルゴンのイオンビーム、炭素イオンビームでも表面に与えるエネルギー（LET）が異なるもの2種、そして比較対照のUV照射を行った。その結果、イオン種によって生菌率や5-FOA耐性変異株（＝ウラシル要求性候補株）が得られる効率が異なることが分かった。なお、得られたK701の5-FOA耐性変異株について、ウラシルが含まれていない最少培地で培養を長時間行うと、変異が元に戻るためか増殖してくるものがあるため、5日目までに成育してきた株は、変異が不安定であると考え、除外した。続いて、ウラシル要求性が確認された変異株77株と、親株のK701を用い、バイオフォトレコーダーを用いて増殖性を調べた。2021年度の実験では、YM培地で培養したところ、ウラシル要求性株の最大増殖量が親株より大きく下がっていたことから、YM培地にはウラシルが不足していることが考えられていた。そこで、最少培地にウラシルを添加する量とされている40ppmをYM培地に添加してみたが、K701の増殖速度と増殖量にまで改善する効果は無かった。しかしながら、ウラシル要求性株間で増殖速度に差が認められたため、初期菌体量（OD660）が0.1となるように接種し、OD660が1.0になるまでの時間を調べた。その結果、K701では約8時間でOD660が1.0になったのに対し、全てのウラシル要求性株は、K701よりも増殖に大きな遅延が見られた。UVおよびC220照射によって得られた変異株は、株間の増殖速度の差が少ないのに対し、He50、C320照射の場合は差が大きかった。各種の変異処理方法で取得したウラシル要求性株について、URA3とURA5遺伝子配列を解析したところ、変異が確認されたものが複数得られたので、全ゲノム配列の解析を実施した。

使用Kyokai Sake Yeast No.701（K701），除了传统的碳离子束之外，还对氦、氖、氩离子束以及施加到表面的不同能量（LET）的两种碳离子束A对照UV进行了比较。进行了照射。结果发现，获得5-FOA抗性突变株(=需要尿嘧啶的候选株)的存活率和效率根据离子种类而不同。对于获得的K701的5-FOA抗性突变株，如果在不含尿嘧啶的基本培养基中长时间培养，其中一些会增殖，可能是因为突变恢复到了原始状态的菌株。长大到这一点被认为具有不稳定突变并被排除。接下来，我们使用生物光记录仪检查了77个被确认需要尿嘧啶的突变菌株和亲本菌株K701的生长潜力。 2021年实验中，在YM培养基中培养时，尿嘧啶营养缺陷型菌株的最大生长速率明显低于亲本菌株，因此认为YM培养基中缺乏尿嘧啶。因此，我们尝试在YM培养基中添加40ppm的尿嘧啶，这是基本培养基中应添加的量，但对提高K701的生长速度和量没有效果。然而，由于在需要尿嘧啶的菌株之间观察到生长速度的差异，因此进行接种以使初始细菌质量(OD660)为0.1，并研究直到OD660达到1.0的时间。结果，K701 在约 8 小时内达到 OD660 1.0，而所有尿嘧啶营养缺陷型菌株均表现出比 K701 更大的生长延迟。通过UV和C220照射获得的突变菌株显示菌株之间的生长速率差异很小，而在He50和C320照射的情况下差异较大。当我们对通过各种突变处理方法获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株的URA3和URA5基因序列进行分析时，我们发现了多个菌株已确认突变，因此我们进行了全基因组序列分析。

项目成果

清酒酵母のイオンビーム育種技術に関する研究

清酒酵母离子束育种技术研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 渡部貴志;佐藤勝也;増渕隆;大野豊
• 通讯作者: 大野豊

ウラシル要求性を指標にした清酒酵母のイオンビーム育種技術に関する研究

以尿嘧啶需求量为指标的清酒酵母离子束育种技术研究

• 发表时间: 2023
• 作者: 渡部貴志;佐藤勝也;大野豊;田島創
• 通讯作者: 田島創