光スイッチを用いた次世代型不妊魚作出法の開発

利用光开关开发下一代不育鱼生产方法

基本信息

批准号：
21K19133
负责人：
林誠
金额：
$ 4.08万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19133/
关键词：
光スイッチニジマス CRISPR/Cas9 魚類不妊魚

项目摘要

不妊化技術は養殖場から逃亡した個体による遺伝子汚染への対応策として、また、作出した優良系統のコピー防止策として、幅広い水産分野において注目されており、安定した簡便な不妊魚作出法の開発が期待されている。しかし、不妊化技術における大きな問題の一つは、不妊化した個体からは次世代を得ることができないことにある。そのため、ヘテロで系統を維持する必要があり、その交配で得られた次世代では1/4しか不妊にならないため、不妊魚の選抜を行う必要があるのが現状である。そこで、本研究では新たな不妊魚の大量生産技術として、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9法の有用性を検討することを目標に研究を行う。これまで、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9は、培養細胞をはじめマウスなどにおいて利用されている。しかし、魚類、特にニジマスなど低水温環境で飼育される魚類においても光スイッチを利用したCRISPR/Cas9を用いた報告はないのが現状である。そこで、ニジマスをモデルとして、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9が利用可能かどうかを確かめることとした。そのために、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9の作用を容易に判別できるように、体色遺伝子の一つである、slc45a2遺伝子に着目した。この遺伝子はメラニン合成に関わるため、その機能を破壊すると黒色素が欠損し、アルビノの表現型を示す。そこで、slc45a2に対するgRNAをを発現させるためにニジマスで利用できると思われるU6プロモーターを検討し、そのコンストラクトと、光反応性のCRISPR/Cas9を全身で発現させるコンストラクトをデザインした。

绝育技术作为防止从养鱼场逃逸的个体造成的基因污染的对策，以及作为防止复制已创建的优良品种的措施，正在引起广泛渔业领域的关注，并开发出稳定且简单的技术。期望生产不育鱼的方法。然而，绝育技术的主要问题之一是无法从绝育个体中获得下一代。因此，需要维持杂合鱼的谱系，并且由于通过杂交获得的下一代只有四分之一是不育的，因此目前需要选择不育鱼。因此，本研究旨在探讨使用光开关的CRISPR/Cas9方法作为一种新的不育鱼大规模生产技术的实用性。到目前为止，使用光学开关的 CRISPR/Cas9 已用于培养细胞和小鼠。然而，目前还没有关于利用光学开关的CRISPR/Cas9在鱼类，特别是在虹鳟鱼等低水温环境中饲养的鱼类中使用的报道。因此，我们决定使用虹鳟鱼作为模型，看看是否可以使用使用光开关的CRISPR/Cas9。为此，我们重点研究了体色基因之一的 slc45a2 基因，以便使用光开关轻松确定 CRISPR/Cas9 的效果。该基因参与黑色素合成，因此如果其功能被破坏，黑色素就会丢失，导致白化病表型。因此，我们研究了可用于虹鳟鱼中表达slc45a2 gRNA的U6启动子，并为其设计了一个构建体以及一个用于在全身表达光反应性CRISPR/Cas9的构建体。