Development of the translation machinery to incorporate multiple D-amino acids into a peptide via alteration of the ribosome tunnel

开发翻译机制，通过改变核糖体通道将多个 D-氨基酸整合到肽中

• 批准号: 18J12342
• 负责人: 田島 研也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12342/
• 关键词: ペプチジル-tRNAの脱落; リボソームストール; EF-P; プロリン; ペプチド新生鎖; 翻訳系; D-アミノ酸; リボソーム; ペプチジル-tRNA; L-プロリン

本研究は、ペプチド鎖へのD-アミノ酸導翻訳効率を指標としてペプチド新生鎖配列を分類し、任意のペプチド新生鎖に効率よくD-アミノ酸を導入可能な変異体リボソームの開発を目的としている。D-アミノ酸を含むペプチドはその高いプロテアーゼ耐性によって生体内で長期間作用するペプチド薬剤開発の基盤として期待される。近年の試験管内翻訳系の最適化とD-アミノ酸導入に用いるtRNAの改良によりペプチドへのD-アミノ酸連続導入が可能となったが、L-アミノ酸と比較して導入効率は未だ非常に低い。本研究では、D-アミノ酸導入効率が導入されるペプチド新生鎖配列に依存するという知見に基づき、ペプチド新生鎖が通過するリボソームのトンネルを最適化することで導入効率の向上を目指した。昨年度、D-アミノ酸同様ペプチドへの連続導入効率が低いL-プロリンを用いて、ペプチド新生鎖配列依存的な導入効率を網羅的に評価する試験管内系の構築に成功し、導入効率を制御するペプチド新生鎖配列の傾向の分析に成功した。この結果に基づいて、今年度はプロリンに焦点を当ててこのような現象が生体内の翻訳系でおこるか検証した。検証には配列中にポリプロリンモチーフを含むタンパク質配列を複数選択し、これらをコードしたプラスミドDNAを調整した後これを用いて大腸菌を形質転換しタンパク質を発現した。タンパク質を精製した後、プロテアーゼを用いて消化した後、LC-MSを用いてそれぞれの配列を決定した。その結果、試験管内系で得られた結果と同一の結果を得ることができ、上記の現象が生体内の翻訳系でも起きることが実証された。現在これらの結果をまとめて投稿論文を作成中である。

本研究的目的是以D-氨基酸翻译成肽链的效率为指标对肽原链序列进行分类，并开发能够有效地将D-氨基酸引入任意肽原链的突变核糖体。由于其高蛋白酶抗性，含有 D-氨基酸的肽有望成为开发在体内长期发挥作用的肽药物的基础。最近体外翻译系统的优化和用于D-氨基酸引入的tRNA的改进使得将D-氨基酸连续引入肽中成为可能，但与L-氨基酸相比，引入效率仍然很低。在本研究中，基于D-氨基酸导入效率取决于导入的肽新生链序列的知识，我们旨在通过优化肽新生链通过的核糖体隧道来提高导入效率。去年，我们成功构建了一个体外系统，综合评估了使用L-脯氨酸对肽新生链的序列依赖性引入效率，该系统对D-氨基酸等肽的连续引入效率较低，并控制了引入效率。成功分析了肽新生链序列的趋势。基于这些结果，今年我们将重点放在脯氨酸上，以检查这种现象是否发生在体内翻译系统中。为了验证，选择了多个含有聚脯氨酸基序的蛋白质序列，并制备了编码这些序列的质粒DNA并用于转化大肠杆菌以表达蛋白质。纯化蛋白质并用蛋白酶消化后，使用 LC-MS 确定它们各自的序列。结果，我们能够获得与体外系统相同的结果，证明上述现象也发生在体内翻译系统中。我们目前正在将这些结果汇编成一篇论文以供提交。

项目成果

プロリンの翻訳導入に対する新生ペプチド配列とEF-G濃度の影響の網羅的評価

综合评价新生肽序列和EF-G浓度对脯氨酸翻译引入的影响

• 发表时间: 2018
• 作者: 田島研也;加藤敬行;菅裕明
• 通讯作者: 菅裕明

Comprehensive elucidation of effect of nascent peptide sequences and EF-G concentration on incorporation of prolines in translation

全面阐明新生肽序列和 EF-G 浓度对翻译中脯氨酸掺入的影响

• 发表时间: 2018
• 作者: Kenya Tajima; Takayuki Katoh; Hiroaki Suga
• 通讯作者: Hiroaki Suga

Comprehensive elucidation of effect nascent peptide sequences and EF -G concentration on incorporation of prolines in translation

全面阐明新生肽序列和 EF -G 浓度对翻译中脯氨酸掺入的影响

• 发表时间: 2019
• 作者: Kenya Tajima; Takayuki Katoh; Hiroaki Suga
• 通讯作者: Hiroaki Suga

プロリンの翻訳導入に対するペプチド新生鎖配列とEF-G濃度の影響の網羅的評価

综合评价肽新生链序列和EF-G浓度对脯氨酸翻译引入的影响

• 发表时间: 2018
• 作者: 田島研也;加藤敬行;菅裕明
• 通讯作者: 菅裕明