褐藻のバイオエタノール変換を目指した酵母共培養プラットフォームの構築

褐藻生物乙醇转化酵母共培养平台的构建

基本信息

批准号：
18J10103
负责人：
佐々木勇輔
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度では、その適応進化をゲノミクスの視点から解析した。本年度は、その解析結果に基づき、in vitro およびin vivoにおけるreverse engineeringを実施し、同定した遺伝子変化を評価した。適応進化株の全ゲノム比較解析により、アルギン酸代謝に関わるDehRレダクターゼにおいて、非同義変異（T16K）を同定した。その変異型酵素の活性を野生型と比較評価するため、それぞれ大腸菌（BL21）で生産後、His-tag精製を行った。精製酵素を用いて、補酵素NAD(P)Hに対するKmとKcatを算出した。その結果、変異型DehRでは、NADH/NADPH比率が0.89と野生型の21.8%になっていることがわかった。NADHに対するKcatは、変異型で1.1倍の増加に対して、NADPHに対するKcatは、1.6倍の増加であることより、T16Kの変異は、DehRのNADPHに対する酵素活性を特に向上させたと考えられる。T16Kが酵素活性向上にどのように寄与しているのか、解明するため、野生型・変異型DehRのタンパク質モデルを作成し、補酵素をbinding siteへドッキングさせたシミュレーションを実施した。その結果、T16部位は、ループ構造を形成して補因子と結合し、酸素と相互作用する箇所であることがわかった。16K変異は、そのプール構造と隣接するヘリックスとの空間を拡張する。その空間によって、変異型ではNADPがより許容され、酵素活性の向上につながったと考えられる。

去年我们从基因组学的角度分析了它的适应性进化。今年，根据分析结果，我们进行了体外和体内逆向工程，并对识别出的基因变化进行了评估。对适应性进化菌株的比较全基因组分析发现 DehR 还原酶中存在非同义突变 (T16K)，该酶参与藻酸盐代谢。为了评估突变酶与野生型酶的活性，每种酶在大肠杆菌 (BL21) 中产生，然后纯化 His 标签。使用纯化的酶计算辅酶 NAD(P)H 的 Km 和 Kcat。结果显示，突变体DehR的NADH/NADPH比值为0.89，是野生型的21.8%。在突变型中，NADH 的 Kcat 增加了 1.1 倍，而 NADPH 的 Kcat 增加了 1.6 倍，这表明 T16K 突变特别提高了 DehR 对 NADPH 的酶活性。为了阐明 T16K 如何有助于提高酶活性，我们创建了野生型和突变型 DehR 的蛋白质模型，并进行了模拟，其中辅酶与结合位点对接。结果发现，T16位点形成环结构，与辅因子结合，并与氧相互作用。 16K 突变扩大了池结构和相邻螺旋之间的间距。由于这个空间，NADP 在突变型中更容易被允许，这被认为导致了酶活性的提高。

项目成果

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专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Engineering Corynebacterium glutamicum to produce the biogasoline isopentenol from plant biomass hydrolysates

改造谷氨酸棒杆菌以从植物生物质水解产物中生产生物汽油异戊烯醇

DOI：
10.1186/s13068-019-1381-3
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
6.3
作者：
Yusuke Sasaki; Thomas Eng; Robin A. Herbert; Jessica Trinh; Yan Chen; Alberto Rodriguez; John Gladden; Black A. Simmons; Christopher J. Petzold; Aindrila Mukhopadhyay
通讯作者：
Aindrila Mukhopadhyay

Elucidation of Enigma in Adaptationally Evolved Saccharomyces cerevisiae for Ethanol Production from Brown Macroalgae

阐明适应性进化的酿酒酵母从褐藻生产乙醇的谜团

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yusuke Sasaki; Yasuo Yoshikuni
通讯作者：
Yasuo Yoshikuni

DOE Joint Genome Institute(米国)

DOE 联合基因组研究所（美国）

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Production of Tetra-methylpyrazine Using Engineered C. glutamicum

使用工程谷氨酸棒杆菌生产四甲基吡嗪

DOI：
10.1016/j.mec.2019.e00115
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
5.2
作者：
Thomas Eng; Yusuke Sasaki; Robin Herbert; Andrew Lau; Jessica Trinh; Yan Chen; Mona Mirsiaghi; Christopher J. Petzold; Aindrila Mukhopadhyay
通讯作者：
Aindrila Mukhopadhyay

Elucidation of Enigma in Adaptationally Evolved Saccharomyces cerevisiae for Ethanol Production from Brown Macroalgae

阐明适应性进化的酿酒酵母从褐藻生产乙醇的谜团