卵巣移行シグナルを利用した新規遺伝子改変法

利用卵巢迁移信号的新基因修饰方法

基本信息

批准号：
18J10121
负责人：
村上悠
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度は卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン（Vtg）の部分配列（N末300 aa：以下Vtgシグナル）により、緑色蛍光タンパク質（GFP）および発光タンパク質ルシフェラーゼ（LUC）を含む外来タンパク質を卵内へ効率的に輸送できることを見出した。一方でVtgシグナルでは最終目的とするゲノム編集ツール（Cas9）を含めた融合タンパク質（Cas9: GFP）を卵内へ送達できなかったため、Vtgの全長配列を用いることで輸送効率の向上を図った。具体的にはゲノム編集技術CRISPR/Cas9 systemを駆使し、Vtgの終止コドンの直前にCas9: GFP: polyAをノックインしたメダカを作出した。系統化を完了した後、本ノックインメダカについて蛍光観察を行うと、肝臓で明瞭な緑色蛍光が観察された。加えて、本メダカが産出した全ての卵においても明瞭かつ均一な緑色蛍光を確認できた。Vtgシグナルによって本融合タンパク質の輸送を試みた際は、卵内で緑色蛍光が見られなかったため、本結果は全長配列の利用によって狙い通り輸送効率の改善に成功したことを示す。続いて卵内でのCas9のヌクレアーゼ活性を評価するため、標的遺伝子（slc45a2; 黒色色素の合成に関連）を認識するsgRNAを受精卵内へ顕微注入した。注入卵はHeteroduplex mobility assay（HMA）解析によってslc45a2の変異の有無を確認したが、いずれのサンプルからも変異活性を示す結果は得られなかった。この原因としては、Cas9が卵内へ流入する前後で分解されたこと、あるいは卵内でのCas9の蓄積量が不足していること等が考えられる。Vtgは卵内に取り込まれた後、複数のドメインごとに限定分解されることが既知である。したがって各ドメイン間にCas9: GFP: polyAをノックインすることでこの現状の打開を図っている。

去年，我们利用蛋黄蛋白前体卵黄蛋白原（Vtg）的部分序列（N端300个氨基酸：以下简称Vtg信号），高效引入了绿色荧光蛋白（GFP）和发光蛋白荧光素酶（LUC）等外源蛋白。）我发现它可以运输。另一方面，Vtg信号无法将含有基因组编辑工具（Cas9）的最终目标融合蛋白（Cas9：GFP）递送到鸡蛋中，因此他们寻求通过使用全长Vtg序列来提高运输效率。具体来说，他们使用基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统创造了青鳉鱼，其中Cas9：GFP：polyA在Vtg的终止密码子之前被敲入。完成系统学分析后，我们对这只敲入青鳉进行了荧光观察，在肝脏中观察到清晰的绿色荧光。此外，该青鳉产下的所有卵均显示出清晰且均匀的绿色荧光。当我们尝试使用Vtg信号转运该融合蛋白时，在鸡蛋中没有观察到绿色荧光，因此该结果表明我们成功地通过使用全长序列提高了预期的转运效率。接下来，为了评估鸡蛋中 Cas9 的核酸酶活性，我们将识别目标基因（slc45a2；参与黑色素合成）的 sgRNA 显微注射到受精卵中。通过异源双链体迁移率测定（HMA）分析证实了注射卵中是否存在 slc45a2 突变，但没有从任何样品中获得表明突变活性的结果。造成这种情况的可能原因包括Cas9在进入鸡蛋前后被降解，或者鸡蛋中Cas9积累的量不足。已知Vtg被摄入鸡蛋后，会以受限的方式降解成多个域。因此，我们试图通过在每个结构域之间敲入Cas9：GFP：polyA来克服这种现状。