バキュロウイルスによる宿主行動操作の神経基盤の解明

阐明杆状病毒操纵宿主行为的神经基础

基本信息

批准号：
18J00134
负责人：
國生龍平
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、ウイルス感染脳における宿主の発現変動遺伝子（Differentially Expressed Gene: DEG）およびその発現ニューロンの詳細な機能解析を行うことにより、バキュロウイルスが宿主昆虫の脳内の行動中枢を利己的に操作する分子・神経メカニズムを解明することを目標とする。昨年度までに、カイコ培養細胞にCRISPR/Cas13dシステムを導入し、その有効性を実証した。そこで、今年度はCRISPR/Cas13dによるカイコ内在性遺伝子ノックダウン細胞のRNA-seq解析を行ったところ、Cas13d/gRNAの発現により標的遺伝子のmRNAを効率的かつ配列特異的に切断できるが、切断後のRNA断片が少なからず残留することが明らかになった。また、カイコ培養細胞においてCas13d/gRNAを発現させると細胞増殖の減少やhouse-keeping遺伝子の発現低下が見られることが判明した。これらの細胞では一部のトランスポゾンの発現が顕著に上昇していたことから、Cas13d/gRNAがsmall RNA経路に干渉してトランスポゾンの抑制が緩くなったと予想される。したがって、カイコではこうした点を考慮した上でCRISPR/Cas13dを使用する必要があり、今後はこれらの欠点を改善することでツールとしての利便性が上がると考えている。また、今年度はDEGの詳細な機能解析を行うため、ノックイン(TAL-PITCh法)によりDEG発現細胞特異的に外来遺伝子を発現誘導できるGAL4カイコの作出を試みた。しかし、得られたGAL4系統では全くGAL4発現を誘導できなかった。昨年度には中枢神経系特異的遺伝子(nSyb)のGAL4カイコも同様の結果であったことから、カイコにおいては5'UTR領域へのノックインでは標的遺伝子の発現パターンを模倣することが極めて難しい可能性がある。

在这项研究中，我们对病毒感染大脑中的宿主差异表达基因（DEG）及其表达神经元进行了详细的功能分析，并证明杆状病毒自私地操纵宿主昆虫大脑中的行为中心，目的是阐明这一分子机制。以及其背后的神经机制。到去年，我们已将CRISPR/Cas13d系统引入培养的蚕细胞中，并证明了其有效性。因此，今年，我们利用CRISPR/Cas13d对家蚕内源基因敲低细胞进行了RNA-seq分析，发现Cas13d/gRNA的表达可以高效、序列特异性地切割靶基因mRNA；揭示了相当多的RNA；留下了碎片。此外，还发现当Cas13d/gRNA在培养的蚕细胞中表达时，细胞增殖减少，看家基因表达减少。由于这些细胞中某些转座子的表达显着增加，因此预计 Cas13d/gRNA 会干扰小 RNA 途径，从而减少转座子的抑制。因此，考虑到这些点，有必要在蚕中使用CRISPR/Cas13d，并且我们相信，改进这些缺点将使其在未来作为一种工具更加有用。此外，今年，为了对DEG进行详细的功能分析，我们尝试通过敲入（TAL-PICh法）来培育能够在表达DEG的细胞中特异性诱导外源基因表达的GAL4蚕。然而，在获得的GAL4系中根本不能诱导GAL4表达。去年，在家蚕中的中枢神经系统特异性基因（nSyb）GAL4也获得了类似的结果，因此通过敲入5'UTR区域来模拟家蚕中目标基因的表达模式可能极其困难。是。