Multi-target suppression of pro-inflammatory cytokines using engineered targeted ribonucleases

使用工程化靶向核糖核酸酶多靶点抑制促炎细胞因子

基本信息

  • 批准号:
    10282169
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 42.49万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2021
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2021-07-15 至 2023-07-14
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Cytokine storm syndrome (CSS) is a massive and sustained production of pro-inflammatory cytokines and chemokines triggered by sepsis and severe viral infections including COVID-19 and influenza. This hyper- elevation of cytokine signaling drives the localized and ultimately systemic inflammation responsible for the severe and potentially lethal organ damage associated with this syndrome. There are currently no effective drugs to treat CSS, making development of new therapeutic strategies a top priority. In particular, the limited success observed with approaches targeting individual cytokines indicates that methods are needed that can suppress expression or activity of multiple cytokines simultaneously. To address this need, the goal of this exploratory, high-risk/high-reward R21 proposal is to develop a zinc finger-directed RNA-cleaving agent to suppress pro-inflammatory mRNA subpopulations in cells. Our prototypes link the tandem zinc finger (TZF) domain from tristetraprolin (TTP) to an endoribonuclease domain. This RNA targeting module was selected because it recognizes RNA sequences found in the 3'-untranslated regions of many cytokine and chemokine mRNAs. In cells, chimeric TZF-RNase proteins are expected to bind and rapidly degrade these mRNA substrates, but our design will also allow substrate specificity to be systematically modified. This proposal is aimed at providing the “proof of concept” that TZF-RNase chimeras can function as a deliverable, guided RNA degradation system in cells to suppress a pro-inflammatory gene expression program and production/secretion of associated cytokines. First, we will construct a series of TZF-RNase prototypes and optimize for yield, solubility, and metal ion coordination before functionally screening for sequence-specific RNA cleavage activity in vitro and targeted suppression of candidate pro-inflammatory cytokine mRNAs in cells by accelerating mRNA decay. Second, we will express our optimal TZF-RNase prototype in primary cells relevant to CSS and measure transcriptome-wide effects on mRNA levels and mRNA decay kinetics, followed by effects on cytokine secretion profiles from these cell models. In parallel, we will test methods for delivering TZF-RNase protein into cells. Successful completion of this pilot project will establish proof-of-principle that: (i) an engineered targeted nuclease can post-transcriptionally suppress expression and secretion of multiple pro- inflammatory cytokines associated with CSS, and (ii) that this targeted nuclease can be delivered to and functional in CSS-relevant cell types. Several future applications of this technology are also envisioned, including: (i) discovery tools for characterizing RNA-mediated biological pathways, and (ii) expanding the specificity of the TZF-RNase platform by altering its RNA-targeting specificity. Strategies to broaden the scope include the iterative or combinatorial modification of the TZF moiety and substitution of other RNA-binding domains to `guide' the chimeric protein, creating a tunable family of targeted ribonucleases with long-term impact.
细胞因子风暴综合征 (CSS) 是促炎性细胞因子和促炎性细胞因子的大量持续产生 由败血症和严重病毒感染(包括 COVID-19 和流感)引发的趋化因子。 细胞因子信号传导的升高会驱动局部炎症并最终导致全身炎症 目前尚无与此综合征相关的严重且可能致命的器官损伤。 治疗CSS的药物,使得开发新的治疗策略成为当务之急,特别是在有限的情况下。 针对个体细胞因子的方法所观察到的成功表明,需要能够 同时抑制多种细胞因子的表达或活性为了满足这种需要,这是本发明的目标。 探索性、高风险/高回报的 R21 提案是开发一种锌指导向的 RNA 切割剂 抑制细胞中的促炎 mRNA 亚群。我们的原型连接串联锌指 (TZF)。 选择从三四脯氨酸 (TTP) 结构域到核糖核酸内切酶结构域的 RNA 靶向模块。 因为它可以识别许多细胞因子和趋化因子 3'-非翻译区中的 RNA 序列 在细胞中,嵌合 TZF-RNase 蛋白有望结合并快速降解这些 mRNA。 底物,但我们的设计也将允许系统地修改底物特异性。 该提案旨在提供 TZF-RNase 嵌合体可以作为 细胞内可传递、引导的 RNA 降解系统,可抑制促炎基因表达程序 首先,我们将构建一系列 TZF-RNase 原型。 并在功能筛选序列特异性之前优化产量、溶解度和金属离子配位 体外 RNA 裂解活性和细胞内候选促炎细胞因子 mRNA 的靶向抑制 其次,我们将在原代细胞中表达我们的最佳 TZF-RNase 原型。 与 CSS 相关并测量转录组范围内对 mRNA 水平和 mRNA 衰减动力学的影响,随后 同时,我们将测试递送方法。 TZF-RNase 蛋白进入细胞。该试点项目的成功完成将建立以下原理验证:(i) 工程化的靶向核酸酶可以转录后抑制多种前体的表达和分泌 与 CSS 相关的炎症细胞因子,以及 (ii) 这种靶向核酸酶可以被递送至 还设想了该技术在 CSS 相关细胞类型中的几种未来应用。 包括:(i) 用于表征 RNA 介导的生物途径的发现工具,以及 (ii) 扩展 通过改变 RNA 靶向策略来扩大 TZF-RNase 平台的特异性。 包括 TZF 部分的迭代或组合修饰以及其他 RNA 结合的取代 结构域“引导”嵌合蛋白,创建具有长期作用的靶向核糖核酸酶可调家族 影响。

项目成果

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