細胞内における化学合成ヒストンのダイナミクス解析

细胞内化学合成组蛋白的动力学分析

基本信息

批准号：
15J08667
负责人：
末岡拓馬
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

平成29年度は、ヒストンタンパク質の化学合成法を基盤にして、細胞内での動態を可視化するための人工ヒストンの作製に取り組んだ。ヒストンH2AならびにH2Bは二量体を形成し、機能することが知られている。一方で、単量体と二量体との平衡状態や他のシャペロンタンパク質との相互作用など、大部分の挙動については明らかになっていない。本研究では翻訳後修飾や蛍光色素などを導入した合成ヒストンを用いてこれらの課題へアプローチしている。第一に、H2Aの57番目チロシンになされるリン酸化修飾(Y57ph)に関する研究を進めた。前年度に引き続き検証を行った結果、Y57phがH2A-H2B二量体ならびにヌクレオソーム構造を不安定化するという新たな知見を得ることができた。Y57phは転写を促進することが先行研究にて知られており、今回の結果を加味すると、ヒストンの活発な動態に関わる修飾であることが示唆された。第二に、H2A-H2B二量体形成を検出可能なヒストンの合成研究に取り組んだ。2種類の色素を導入したH2Bを合成し、色素間のエネルギー移動を蛍光スペクトルから読み取ることで、細かな構造変化を検出できると考えた。前年度に行った実験では、色素を導入する反応およびその後のアッセイに再現性の観点から難があったため、今年度の実験では確実に色素を導入可能な反応に変更した。その結果、純度良く目的のH2Bを合成することができた。そののちに合成H2Bを用いて再構成実験を行い、H2Aと二量体を形成したときのみ蛍光スペクトルが大きく変化し、H3やH4など他のヒストンと共存させても大きくスペクトルが変化しないことを明確に示した。これにより、設計したH2Bが二量体形成のみを検出できることが実証された。

2017 年，我们致力于创建人工组蛋白，以基于组蛋白的化学合成来可视化细胞内动力学。已知组蛋白 H2A 和 H2B 可形成二聚体并发挥作用。另一方面，大多数行为，例如单体和二聚体之间的平衡状态以及与其他伴侣蛋白的相互作用，仍不清楚。在本研究中，我们使用具有翻译后修饰的合成组蛋白和荧光染料来解决这些问题。首先，我们对H2A第57位酪氨酸的磷酸化修饰（Y57ph）进行了研究。经过前一年的持续验证，我们获得了Y57ph破坏H2A-H2B二聚体和核小体结构稳定性的新知识。先前的研究表明，Y57ph 促进转录，与目前的结果结合起来，表明 Y57ph 是参与组蛋白活性动力学的修饰。其次，我们致力于合成可以检测 H2A-H2B 二聚体形成的组蛋白。通过用两种染料合成 H2B 并从荧光光谱中读取染料之间的能量转移，他们认为可以检测微小的结构变化。在去年进行的实验中，引入染料的反应和随后的测定的再现性方面存在困难，因此今年的实验改为能够可靠地引入染料的反应。结果，我们能够合成所需的高纯度 H2B。之后，我们使用合成的H2B进行了重构实验，发现只有当它与H2A形成二聚体时，荧光光谱才发生显着变化，并且即使与H3和H4等其他组蛋白共存，光谱也没有显着变化。表明的。这表明设计的 H2B 只能检测二聚体形成。