Ｒｕｎｘ２遺伝子の時間的・空間的発現制御および癌化時の発現制御機構の解明

阐明Runx2基因的时空表达控制及癌变过程中的表达控制机制

• 批准号: 15J06615
• 负责人: 松裏 恵子
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J06615/
• 关键词: Runx2; エンハンサー; 骨芽細胞分化; 軟骨細胞分化

本課題ではCRISPR/Cas9システムを用いて、時間的・空間的に骨芽細胞および軟骨細胞分化に強く寄与する有望な新規創薬標的エンハンサーを同定することを目的とする。本年度は14箇所のうち12箇のエンハンサー候補の欠失マウスを作製しており、その後の13箇の表現型をより詳細に解析した。エンハンサー（Runx2-0.76, +637, +1.27, +5.1, 1.8kb）のノックアウトされたマウスを数系統得たので表現型について検討中だが、そのうち5領域（Runx2-0.31, -0.46, +0.77, +0.18, +0.63kb） のノックアウトマウス（KO）における骨・軟骨の表現型解析を行った。その結果、表現型データに変化は見られなかった。一方、３領域をそれぞれ欠損したマウスに関して、Runx2の発現上昇はみられなかったものの（Runx2-0.76：E18.5の頭蓋:骨芽細胞からなる; +1.4kb：E16.5の長管骨:軟骨細胞と骨芽細胞からなる; +1.10kb：E15.5の長管骨:主に軟骨細胞からなる、そうしてE18.5の頭蓋:骨芽細胞からなる）、わずかではあるがRunx2の発現は減少された。特に、8週齢のRunx2+1.10kb KOマウスのマイクロCT解析で、大腿骨や腰椎海綿骨の骨量の減少が認められ、形態学的観察では成長板および脛骨の上関節面の構造は野生型マウスと異なっていた。Runx2遺伝子の発現において強力なエンハンサーとして機能する+1.10kb領域にGFPを加えたTGマウスを作成した。その結果、5週齢のマウスの尾骨が骨化した骨端軟骨板での細胞にGFP陽性細胞の減少とGFP発現強度の低下が観察された。一方、骨幹端および骨幹部の細胞ではGFP陽性細胞数が著しく上昇していた。したがって、+1.10kb領域が骨粗鬆症の新規創薬ターゲットとなり得る。

该项目的目的是利用 CRISPR/Cas9 系统来识别一种有前途的新药物靶点增强剂，该增强剂在时间和空间上对成骨细胞和软骨细胞的分化有强烈贡献。今年，我们培育了 14 个候选增强子中的 12 个缺失的小鼠，然后更详细地分析了 13 个的表型。我们已经获得了几种增强子（Runx2-0.76、+637、+1.27、+5.1、1.8kb）被敲除的小鼠品系，目前我们正在研究其表型，但其中有5种（Runx2-0.31、对-0.46、+0.77、+0.18、+0.63kb）敲除小鼠（KO）进行骨和软骨表型分析。结果，在表型数据中没有观察到变化。另一方面，在缺乏这三个区域中的每一个的小鼠中，尽管没有观察到 Runx2 表达的增加（Runx2-0.76：E18.5 处的颅骨：由成骨细胞组成；+1.4kb：E16.5 处的长骨：由软骨细胞和成骨细胞； +1.10 kb：E15.5长骨：主要由软骨细胞组成，E18.5颅骨：由成骨细胞组成），Runx2表达略有减少。特别是8周龄Runx2+1.10kb KO小鼠的显微CT分析显示股骨和腰椎松质骨骨量减少，形态学观察显示生长板和上关节面结构发生改变。胫骨与野生小鼠相似，但类型不同。我们创建了 TG 小鼠，其中 GFP 添加到 +1.10kb 区域，作为 Runx2 基因表达的强增强子。结果，在5周龄小鼠尾骨骨化的骨骺软骨板中观察到GFP阳性细胞数量减少和GFP表达强度降低。另一方面，干骺端和骨干细胞中GFP阳性细胞的数量显着增加。因此，+1.10kb区域可能作为骨质疏松症新药发现靶点。

项目成果

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