オートファゴソーム・リソソーム融合の分子メカニズムの解析

自噬体-溶酶体融合的分子机制分析

基本信息

批准号：
15F15082
负责人：
水島昇
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15F15082/
关键词：
オートファゴソームリソソーム

项目摘要

オートファジーは細胞質の一部をリソソームで分解するための進化的に保存された細胞機能である。細胞質を取り囲んだオートファゴソームとリソソームが融合することで分解が達成される。リソソームとオートファゴソームの融合にはSNAREタンパク質であるSyntaxin 17（STX17）、SNAP29、VAMP8、および繋留因子としてHOPS複合体が必要である（Jiang et al. Mol Biol Cell 2014）。STX17は完成されたオートファゴソームにのみ結合し、まだ閉鎖が終わっていない形成中間体には結合しない。また、STX17はオートファゴソームだけではなく、ミトコンドリアや小胞体にも局在する。しかし、飢餓時にはミトコンドリアや小胞体への局在は軽減し、オートファゴソームに効率よく集積する。そこで、オートファゴソームとリソソームの融合機構を明らかにする一端として、本研究では栄養飢餓依存的にSTX17が特異的にオートファゴソームへ局在できるメカニズムを明らかにすることを目指した。HeLa細胞、HEK293T細胞、マウス線維芽細胞にGFP融合したSTX17 cDNAをコードするレトロウイルス、あるいはプラスミドを用いて遺伝子導入し、ウェスタンブロット法および蛍光顕微鏡法によって解析した。オートファジーを誘導しうる飢餓によってSTX17はミトコンドリアや小胞体から離脱し、よりオートファゴソームに結合しやすくなる。そこで飢餓依存的にSTX17分子自体に変化が生じている可能性を考え、ウェスタンブロット法による解析を行った。その結果、飢餓によってGFP-STX17のバンドが一部上方にシフトすることが判明した。これは脱リン酸化酵素処理によって消失するため、STX17のリン酸化型であると考えられた。この修飾がSTX17の局在決定に関与する可能性が示唆された。

自噬是一种进化上保守的细胞功能，可降解溶酶体中的部分细胞质。降解是通过细胞质周围的自噬体与溶酶体的融合来实现的。溶酶体和自噬体的融合需要 SNARE 蛋白 Syntaxin 17 (STX17)、SNAP29、VAMP8 和 HOPS 复合物作为束缚因子 (Jiang et al. Mol Biol Cell 2014)。 STX17 仅与已完成的自噬体结合，而不与尚未关闭的中间体结合。此外，STX17不仅定位于自噬体，还定位于线粒体和内质网。然而，在饥饿期间，线粒体和内质网的定位减少，并且它有效地在自噬体中积累。因此，作为阐明自噬体和溶酶体之间融合机制的一部分，本研究旨在阐明STX17以营养饥饿依赖性方式特异性定位于自噬体的机制。使用逆转录病毒或编码 GFP 融合的 STX17 cDNA 的质粒将基因引入 HeLa 细胞、HEK293T 细胞和小鼠成纤维细胞中，并通过蛋白质印迹和荧光显微镜进行分析。饥饿会诱导自噬，导致 STX17 与线粒体和内质网脱离，使其更有可能与自噬体结合。因此，考虑到STX17分子本身以饥饿依赖性方式发生变化的可能性，我们使用Western blotting进行了分析。结果发现，饥饿使 GFP-STX17 条带部分上移。这被认为是 STX17 的磷酸化形式，因为它通过去磷酸化酶处理而消失。有人认为这种修饰可能与确定 STX17 的定位有关。