ウシ心筋ＦｏＦ１ＡＴＰ合成酵素の機能する完全複合体の構造解析

牛心脏FoF1ATP合酶功能完整复合物的结构分析

• 批准号: 13J05370
• 负责人: 慈幸 千真理
• 金额: $ 1.53万
• 依托单位: Osaka University (2014-2017)University of Hyogo (2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J05370/
• 关键词: 哺乳動物; 膜蛋白質複合体; 三次元結晶化; 膜蛋白質; 三次元結晶; 電子顕微鏡観察

FoF1ATP合成酵素の全体構造は非常に不安定なため50年以上にわたる構造研究によっても高分解能で決定されておらず、その反応機構の解明が困難に陥っている。申請者は、人工的な脂質二重膜に再構成させ本酵素を安定化させる二次元結晶化により、世界で初めて脂質二重膜に埋まったその全長の構造解析に成功したが（Jiko et al., eLife, 2015）、分解能が24オングストロームと充分でなかったために反応メカニズムの解明には至らなかった。また、精製過程でイオン交換クロマトグラフィを使用することで膜間ドメインから解離を始めることが我々の単粒子構造解析によって明らかになり、精製された試料の均一性が低いことがわかった。この結果をもとに申請者は、これまで蛋白質に負荷のかからない密度勾配遠心分離法による精製方法の開発に専念し、非常に安定で無傷な本酵素を精製することに成功した。この精製方法で得られたサンプルに対し予備的なクライオ電子顕微鏡顕観察を行ったところ、完全な本酵素の均一な像を確認でき、クライオ電子顕微鏡による高分解能単粒子解析に値する試料調整が可能であることが判明した。本研究では、全体酵素の大量調整を行い、共同研究による単粒子構造解析と申請者自身による三次元結晶化・X線結晶構造解析によりFoF1ATP合成酵素の完全な構造を高分解能で決定し、哺乳動物のプロトン駆動ATP合成過程の全容を解明することを目指している。

FOF1ATP合酶的整体结构极为不稳定，即使经过50多年的结构研究，也没有在高分辨率下确定它，因此很难澄清反应机制。申请人成功地分析了脂质双层膜的整个长度的结构结构，这是通过将其重构为人造脂质双层膜并稳定酶（Jiko等人，Elife，2015），但分辨率不足以使24仅在24仅仅能的机制上，因此，分辨率不足。此外，我们的单个粒子结构分析表明，在纯化过程中使用离子交换色谱法开始从膜间域解离，表明纯化样品的均匀性很低。基于这些结果，申请人专注于使用不加载蛋白质的密度梯度离心方法开发纯化方法，并成功地纯化了极其稳定且完整的酶。在冷冻电子显微镜下进行了对通过这种纯化方法获得的样品的初步观察，发现确认了该酶的完美均匀图像，并且可以使用冷冻电子显微镜进行高分辨率单颗粒分析的样品制备。这项研究旨在通过通过协作研究分析以及申请人自己的3D结晶和X射线晶体学分析来确定FOF1ATP合酶的完整结构，并通过质量调整整体酶，并通过质量调整整体酶来确定FOF1ATP合酶的完整结构。

项目成果

Electron crystallography of tomographic volumes.

断层扫描体积的电子晶体学。

• 发表时间: 2016
• 作者: Kazutoshi Tani;Karen Davies;Chimari Jiko;Shintaro Maeda;Kyoko Shinzawa-Itoh;Deryck Mills;Tomitake Tsukihara;Yoshinori Fujiyoshi;Werner Kuhlbrandt;Christoph Gerle
• 通讯作者: Christoph Gerle