ゲノム安定性維持に関わるユビキチンリガーゼＣＲＬ４‐Ｃｄｔ２の活性制御機構の解析

泛素连接酶CRL4-Cdt2参与维持基因组稳定性的活性控制机制分析

基本信息

批准号：
13J07320
负责人：
林晃世
金额：
$ 2.05万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J07320/
关键词：
DNA複製ユビキチン細胞周期クロマチン PCNA Cdt2

项目摘要

本研究は、ゲノム安定性維持に重要なユビキチンリガーゼCRL4-Cdt2が、どのようにS期のクロマチン上でのみ機能するか、その分子機構の解明を目指し、PCNAのDNAへのローディングがCRL4-Cdt2や基質の集合とユビキチン化活性を制御する可能性を検証してきた。今年度は、1.DNA結合PCNAへのCRL4-Cdt2、基質Cdt1の分子集合過程を詳細に解析し、2.他の活性制御因子の探索を行った。1. Cdt2のC末端にPIPボックスが見つかったので、CRL4-Cdt2(PIP変異体)を精製し、DNAビーズを用いてプルダウンした。その結果、Cdt2のPIP変異体ではDNA結合PCNAへの結合が抑制された。また、Cdt2のDNA結合PCNAへの結合は、基質の有無で変化しなかった。これまで、Cdt2はN末端のWD40リピートを介して基質-PCNA複合領域を認識すると考えられてきたが、Cdt2のPIPボックスを介したPCNAへの結合によって、基質-PCNAの結合を必要としないことが明らかとなった。また、DNAなしではCdt2はPCNAとほとんど結合しなかったことから、PCNAのDNAへのロードが、基質とCdt2の集合に必須の過程であることが示された。2. 特異的E2が CRL4-Cdt2のポリユビキチン化能を促進する可能性を検討するため、32種の精製E2を購入し、in vitroユビキチン化反応でスクリーニングした。その結果、これまで使用してきたUbcH5cより活性が高いE2候補をいくつか得た。現在、細胞内で基質分解に関与するかをsiRNAによって検討している。本研究では、PCNAのロードが基質、Cdt2がDNA上へ集合、ユビキチン化するために必須であることを直接証明した。加えて、さらなるユビキチン化促進因子の可能性も見出した。

这项研究旨在阐明泛素连接酶CRL4-CDT2的分子机制，这对于维持基因组稳定性很重要，仅在S期染色质上起作用，并检查将PCNA加载到DNA中的可能性调节CRL4-CDT2和底物组装和泛素化活性。今年，我们详细分析了CRL4-CDT2和底物CDT1的分子组装过程中的DNA结合PCNA，并研究了其他活性调节剂。 1。在CDT2的C端发现了一个PIP盒，因此将CRL4-CDT2（PIP突变体）纯化并使用DNA珠将其拉下。结果，在CDT2的PIP突变体中抑制了与DNA结合PCNA的结合。此外，CDT2与DNA结合PCNA的结合不会随着底物的存在或不存在而变化。到目前为止，人们认为CDT2通过N末端WD40重复识别底物-PCNA复合物区域，但是CDT2通过PIP盒与PCNA结合表明，它不需要底物-PCNA结合。此外，没有DNA，CDT2与PCNA没有结合，表明将PCNA加载到DNA中是底物和CDT2组装的重要过程。 2。为了调查特定E2促进CRL4-CDT2的多泛素化能力，购买并筛选了32个纯化的E2以进行体外泛素化反应。结果，我们获得了一些E2候选者，这些候选者比UBCH5C更活跃，迄今为止，我们已经用完了。目前，正在研究siRNA是否参与细胞内的底物降解。在这项研究中，我们直接证明了PCNA负载对于底物CDT2至关重要，以组装和泛素化在DNA上。此外，我们还发现了进一步泛滥因素的可能性。