糖鎖プロセシング酵素と相同性を有する酵素の立体構造解析に基づく新規オリゴ糖の創出

基于与糖链加工酶同源的酶的 3D 结构分析创建新的寡糖

• 批准号: 13J07279
• 负责人: 宮崎 剛亜
• 金额: $ 1.32万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J07279/
• 关键词: N結合型糖鎖; 糖質加水分解酵素; オリゴ糖; X線結晶構造解析; グライコシンターゼ; フッ化糖; グルコシダーゼ; ガラクトシダーゼ

本研究は、真核生物の有するN結合型糖鎖プロセシング酵素およびそれと相同性を有する細菌由来機能未知酵素を対象とし、X線結晶構造解析に基づく反応機構の解明および基質特異性に関わるアミノ酸残基の特定、さらにグライコシンターゼ化による有用なオリゴ糖および糖鎖合成酵素を作出することを目的とした。前年度より引き続き、プロセシングα-グルコシダーゼⅠが属する糖質加水分解酵素ファミリー63（GH63）、そしてプロセシングα-グルコシダーゼⅡが属するファミリー31（GH31）の酵素について研究を行い、主に以下の成果を得た。1. 大腸菌由来GH63酵素YgjKは前年度までに二糖2-O-α-グルコシルガラクトースを生成する2種類のグライコシンターゼ変異体（D324NおよびE727A）を得ている。前年度に行った二糖との複合体構造解析に基づき新たな変異体を構築し、糖の合成能を比較した。その結果、GH63酵素の活性部位近傍に保存されているチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異体のオリゴ糖合成能が最も高いことがわかった。2. 近年グルコシル-/マンノシル-グリセリン酸加水分解酵素と同定された好熱菌由来GH63酵素（Tt8MGH）のX線結晶構造解析を行った。Tt8MGHのアポ構造、生成物であるグルコースまたはグリセリン酸との複合体構造を1.67-2.10 Å分解能で決定し、Tt8MGHに特徴的な3つのループが基質認識に関与していることがわかった。3. 細菌由来GH31機能未知酵素（PsGal31A）の大腸菌発現系の構築、組換え酵素の性質解析を行ったところ、GH31として初めてα-ガラクトシダーゼ活性を示す酵素であることがわかった。また、X線結晶構造解析によりPsGal31Aの立体構造を明らかにし、本酵素のユニークな基質特異性に関する知見を得た。以上の成果により、GH31およびGH63に属するユニークな基質特異性を有する加水分解酵素を新規なオリゴ糖合成酵素に変換するための基盤を確立した。

这项研究的重点是与它们具有同源性的细菌的真核生物和未知功能酶的N连接的聚糖加工酶，其目的是阐明基于X射线晶体结构分析的反应机制，基于X射线晶体结构分析，鉴定与惯性特异性相关的氨基酸残基，并通过产生有用的寡糖酶和Gglycucan synththessys sys-Glycan syntthesy sysntsys sys-Glycan syntthsy sys-Glycase syncsy syncsys syncsy。从上一年开始，我们继续研究碳水化合物水解酶家族的酶63（GH63），加工α-葡萄糖苷酶I属于该酶，家族31（GH31）的酶为α-葡萄糖苷酶II的加工属性属于该酶II，并在下面获得了结果。 1。大肠杆菌的GH63酶YGJK已获得两种类型的糖合酶突变体（D324N和E727A），这些突变体（D324N和E727A）通过上一年产生2-O-O-α-葡萄糖基乳糖糖。基于上一年进行的二糖的复合物的结构分析，构建了新的突变体，并比较了糖的能力。结果，发现在GH63酶的活性位点附近保守的酪氨酸残基的突变体具有合成寡糖的最高能力。 2.近年来，近几年已鉴定为葡萄糖基 - /甘露糖基甘油酸水解酶的X射线晶体结构分析（TT8MGH）的GH63酶（TT8MGH）。在1.67-2.10Å的分辨率下确定TT8MGH及其与产物葡萄糖或糖基酸的复杂结构，发现TT8MGH的三个环特征参与底物识别。 3。用于细菌衍生的GH31功能酶（PSGAL31A）的大肠杆菌表达系统和重组酶的性质的分析表明，GH31是表现出α-乳糖苷酶活性的第一种酶。此外，X射线晶体结构分析揭示了PSGAL31A的三维结构，并找到了有关该酶独特底物特异性的知识。以上结果为将属于GH31和GH63独特的底物特异性转化为新型寡糖合酶的水解酶的基础。

项目成果

α-ガラクトシダーゼ活性を示す新奇な細菌由来GH31グリコシダーゼのX線結晶構造解析

具有 α-半乳糖苷酶活性的新型细菌 GH31 糖苷酶的 X 射线晶体结构分析

• 发表时间: 2014
• 作者: 宮崎 剛亜;市川 めぐみ;西河 淳;殿塚 隆史
• 通讯作者: 殿塚 隆史

Crystal structure and substrate-binding mode of GH63 mannosylglycerate hydrolase from Thermus thermophilus HB8.

来自嗜热栖热菌 HB8 的 GH63 甘露糖基甘油酸水解酶的晶体结构和底物结合模式。

• DOI: 10.1016/j.jsb.2015.02.006
• 发表时间: 2015
• 期刊: Journal of Structural Biology
• 影响因子: 3
• 作者: Takatsugu Miyazaki;Megumi Ichikawa;Hitoshi Iino;Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
• 通讯作者: Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka

Conformational changes and substrate recognition of an uncharacterized glycosidase YgjK belonging to GH63 from Escherichia coil.

属于大肠杆菌 GH63 的未表征糖苷酶 YgjK 的构象变化和底物识别。

• 发表时间: 2013
• 作者: Takatsugu Miyazaki;Megumi Ichikawa;Haruhide Mori;Motomitsu Kitaoka;Yoshikazu Kitano;Atsushi Nishikawa and Tonozuka Tonozuka.
• 通讯作者: Atsushi Nishikawa and Tonozuka Tonozuka.

The side chain of a glycosylated asparagine residue is important for the stability of isopullulanase.

• DOI: 10.1093/jb/mvu065
• 发表时间: 2015-04
• 期刊: Journal of biochemistry
• 影响因子: 2.7
• 作者: T. Miyazaki;H. Yashiro;A. Nishikawa;T. Tonozuka

Pedobacter saltans 由来GH31 α-ガラクトシダーゼとリガンドとの複合体構造解析

Pedobacter saltans GH31 α-半乳糖苷酶与配体复合物的结构分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 宮崎 剛亜;石嵜 雄一;西河 淳;殿塚 隆史
• 通讯作者: 殿塚 隆史