高効率ＤＮＡ内シグナル伝達システムの構築とＤＮＡ光切断を用いた遺伝子操作法の開発

高效DNA内信号转导系统的构建及DNA光裂解基因操作方法的开发

基本信息

批准号：
13J40062
负责人：
田仲真紀子
金额：
$ 3万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では人工ペプチド核酸PNAを用いた光による新たなDNA操作法の開発を目指している。人工核酸PNAは修飾核酸を用いることにより、DNA中の任意の配列をターゲットとしてDNAにインベージョン（侵入）することができる。実用性の観点からは単一のPNA鎖のインベージョンがより汎用性があるが、これまでのところ単一PNA鎖による二本鎖DNAへのインベージョンの報告例はわずかであった。本年度はリボヌクレアーゼA(RNase A)の存在下で単一PNA鎖であっても二本鎖DNAにワトソン・クリック則に基づいて効率的にインベージョンすることを見いだし、その詳細を検討した。電気泳動による各種条件下でのゲルシフトアッセイおよびアニーリング実験の結果より、このような単一PNA鎖のインベージョンは、PNAのインベージョン位置に形成される基質DNAの一本鎖部分へのRNase Aの結合によるインベージョン複合体の安定化、およびRNase A添加による二本鎖DNAの巻き戻しによる不安定化により達成されたと考えられる。このようにPNAの二本鎖DNAへのインベージョンが溶液中に存在するRNase Aによって大幅に促進されることを明らかにした。巨大DNAの特定の配列を正確に認識できる人工核酸PNAのインベージョンの挙動がタンパクの存在によって大きく影響を受けるという結果は、修飾PNAを用いて生体内での部位特異的なゲノム光操作を目指すための重要な知見になると考えられる。

这项研究旨在开发一种使用人工肽核酸PNA来操纵DNA的新方法。通过使用改良的核酸，人造核酸PNA可以使用DNA中的任何序列作为靶标入侵（入侵）DNA。从实际的角度来看，单个PNA链的侵袭更具用途，但是到目前为止，只有少数几例入侵单个PNA链成双链DNA。今年，我们发现，即使在存在核糖核酸酶A（RNase A）的情况下，即使是双链DNA的单个PNA链也可以受到沃森·克里克（Watson-Crick）规则有效入侵，我们检查了细节。 Based on the results of gel shift assays and annealing experiments by electrophoresis under various conditions, it is believed that invasion of such a single PNA strand was achieved by stabilizing the invasion complex by binding of RNase A to the single-stranded portion of the substrate DNA formed at the invasion position of the PNA, and by destabilizing the double-stranded DNA by adding RNase A. Thus, it was revealed that invasion溶液中存在的RNase A大大促进了将PNA的pNA促进双链DNA。人们认为，可以准确识别巨型DNA的特定序列的人造核酸PNA的侵袭行为受到蛋白质的存在的极大影响，被认为是针对使用修饰PNA的体内位点特异性基因组光性在体内的重要发现。