Elucidation of aberrant ketone body metabolism in transporter polymorphisms and establishment of biomarkers

转运蛋白多态性中异常酮体代谢的阐明和生物标志物的建立

• 批准号: 22K11867
• 负责人: 青山 友佳
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Chubu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K11867/
• 关键词: 先天性ケトン体代謝異常; モノカルボン酸トランスポーター(MCT); MCT1; MCT4; ケトン体代謝; 遺伝子多型解析; 先天代謝異常症; 乳幼児突然死; モノカルボン酸トランスポーター; 先天性ケトン体代謝異常症; ケトン体; 分子栄養学

先天性ケトン体代謝異常症は、乳幼児において重篤なケトアシドーシス発作を起こす遺伝性の希少疾患である。ミトコンドリア内のケトン体代謝異常が原因とされるが発症機構は不明な点が多く、乳幼児突然死の原因になる。本研究は、重篤なケトアシドーシス発作につながるケトン体代謝異常において、その重症度の差が生じる原因としての遺伝子変異や一塩基多型が及ぼす、細胞膜とミトコンドリアにおける代謝経路でのケトン体利用の機序を解明することを目標としている。今年度は、ケトン体代謝異常症ではまだ未解明な細胞膜上のトランスポーターであるMCT1、MCT4について、遺伝子多型、タンパクの機能、ケトン体の作用機序について総合的にアプローチするための実験系を構築するため、下記の実験を進めた。①MCT1・MCT4における遺伝子解析：MCT1をコードするSLC16A1、MCT4をコードするSLC16A3遺伝子にて、各エクソンを増幅するためのプライマーの設計、遺伝子解析の条件を確立した。これら遺伝子の一塩基多型の解析を進めるにあたり低侵襲の採血が望ましいと考え、血液ろ紙への微量採血にて乾燥血液ろ紙からのDNA抽出法を確立した。②MCT1・MCT4の抽出とウエスタンブロット解析：MCT1、MCT4蛋白を得るため細胞質タンパクのコンタミネーションを抑える抽出試薬および抗体の検討を行い、ウエスタンブロットによるMCT1、MCT4蛋白の評価が可能となった。β-ケトチオラーゼ欠損症、SCOT欠損症とともにケトン体利用障害の総合的な評価につながる。③MCT1を介した乳酸の代謝とミトコンドリアでのエネルギー代謝評価：MCT1欠損細胞の細胞培養液を低グルコース環境とした条件での乳酸の取り込みとミトコンドリアでのエネルギー産生の代謝解析を行なった。MCT1欠損細胞は野生型細胞と比較し、細胞内外の乳酸濃度が高値であることが明らかとなった。

先天性酮代谢性疾病是一种罕见的遗传性疾病，会引起婴儿和幼儿的严重酮症酸中毒攻击。据说它是由线粒体内部酮代谢异常引起的，但是发作的机理尚不清楚，并且可能导致婴儿猝死。这项研究旨在阐明细胞膜和线粒体中代谢途径中酮体利用的机制，这是由遗传突变和单核苷酸多态性引起的，这些核苷酸多态性导致酮体代谢异常的差异，导致严重的酮酸病酸病攻击。今年，我们进行了以下实验，以建立一个实验系统，以全面接近基因多态性，蛋白质功能以及酮体对MCT1和MCT4的作用机理，这些机理在酮体体内代谢疾病中仍然未知。 1）MCT1和MCT4中的遗传分析：针对编码MCT1的SLC16A1和编码MCT4的SLC16A1设计了用于扩增每个外显子和遗传分析的引物的条件。在这些基因的单核苷酸多态性的分析中，认为最微创的血液收集被认为是理想的，并且通过抽样痕量的血液滤纸来确定从干燥血液滤纸中提取DNA的方法。 2。提取MCT1和MCT4以及Western印迹分析：为了获得MCT1和MCT4蛋白，我们研究了抑制细胞质蛋白污染的提取试剂和抗体，并且可以通过Western Blot评估MCT1和MCT4蛋白。这导致对酮体利用障碍以及β-酮硫醇酶缺乏症和SCOT缺乏症的全面评估。 MCT1介导的乳酸和线粒体能量代谢评估的代谢：在将MCT1缺陷型细胞的细胞培养基置于低葡萄糖环境中的细胞培养基中，对乳酸摄取和线粒体能量产生进行了代谢分析。结果表明，与野生型细胞相比，MCT1缺陷型细胞具有较高的细胞内乳酸浓度。