Development of a chemogenetic activation tool by using a novel ligand-dependent ionotropic receptors

使用新型配体依赖性离子型受体开发化学遗传学激活工具

• 批准号: 22K19363
• 负责人: 小林 和人
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19363/
• 关键词: 化学遺伝学; 神経活動促進; イオン透過型受容体ファミリー; 線条体; 運動制御

我々の研究グループは、これまでに昆虫の興奮性イオン透過型受容体 (ionotropic receptors/IRs) を利用して目的の神経細胞種の活動を選択的に促進させる新規の化学遺伝学技術 (IR-mediated neuronal activation/IRNA) を開発し、フェニル酢酸に高親和性を持つIR84a受容体とその共役受容体であるIR8a受容体からなる複合体を利用した。本研究では、新規のリガンドとしてプロピオン酸に反応するIR75aとIR8a複合体を利用し、線条体ニューロンをモデルに研究を進め、異なるリガンドを用いて複数の神経細胞種の機能を時間・空間的により精密に制御するIRNA技術を確立することを目的とした。本年度は、培養細胞系におけるIR75a/IR8a複合体の反応性の検証するために、レンチウィルスベクターを用いてIR75aとIR8aを共発現する実験系の構築を試みた。受容体発現の検出のために、IR75aについては、シグナルペプチド（推定領域）をヒトカルシニューリンのシグナルペプチドに置換し、EGFPとIR75a成熟タンパク質を融合し、2Aペプチドを介してHAタグを付加したIR8aに連結した。このベクターを HEK293T 細胞あるいは神経芽細胞種 NG108細胞に遺伝子導入し、両者の受容体の発現を免疫組織化学により確認した。最初に選択したシグナルペプチドをヒトカルシニューリンのシグナルペプチドに置換した際は、ほとんど受容体の発現が観察されなかった。そのためシグナルペプチドをより長めに設定し、その領域をカルシニューリンのシグナルペプチドに置換することにより発現量を増加させることに成功した。

我们的研究小组先前已经开发了一种新型的化学遗传学技术（IR介导的神经元激活/IRNA），该技术使用昆虫兴奋性的可渗透受体（离子型受体/IRS/IRS）来选择性地促进神经元类型的兴趣的活性，并使用了由IR84A受体组成的IR84A受体进行固醇酸和IRJACICAID的IR84A受体的复合物。这项研究旨在开发使用IR75A和IR8A复合物的IRNA技术，这些技术对丙酸作为新型配体反应，使用纹状体神经元作为模型，并建立一种IRNA技术，该技术使用不同的配体在时间和空间中更精确地调节多个神经元细胞类型的功能。在今年，我们试图构建一个实验系统，该系统使用慢病毒载体共表达IR75A和IR8A，以验证IR75A/IR8A复合物在培养的细胞系中的反应性。为了检测受体表达，对于IR75a，将信号肽（假定区域）融合为人类钙调蛋白，EGFP和IR75A成熟蛋白的信号肽，并通过2A肽结合以HA标记的IR8A。将该载体转染到HEK293T细胞或神经细胞NG108细胞中，并通过免疫组织化学证实了这两种受体的表达。当最初选择的信号肽被人类钙调蛋白信号肽取代时，很少观察到受体表达。因此，将信号肽设置更长，并用钙调蛋白的信号肽代替区域，从而增加表达水平。

项目成果

Lausanne University(スイス)

洛桑大学（瑞士）